【摘要】：目的觀察Dicer基因脂肪組織特異性敲除后小鼠內臟脂肪占體重的比例變化及內臟脂肪棕色化程度,再誘導Dicer基因敲除的內臟脂肪前體細胞向棕色脂肪細胞分化,探索其可能的分子調控機制,從而闡述Dicer基因與小鼠內臟白色脂肪棕色化的關系。方法1.轉基因小鼠的構建:實驗中,我們將Dicerflox/flox小鼠與Adiponectin-Cre小鼠雜交,從而得到了Adiponectin-Cre;Dicerflox/flox脂肪組織特異性Dicer基因敲除小鼠。記錄小鼠每周體重增長及食物攝入重量。2.轉基因小鼠體內試驗:測定6周成年小鼠的體重,對實驗組和對照小鼠進行糖耐量試驗。提取小鼠內臟脂肪組織稱重,然后4%多聚甲醛固定,石蠟包埋切片后HE染色,比較實驗組和對照組脂肪細胞的大小。抽提內臟白色脂肪RNA,檢測組織中UCP1(解耦聯(lián)蛋白-1)基因的表達量。3.Dicer對內臟脂肪前體細胞誘導分化成棕色脂肪細胞的調控作用:從Dicerflox/flox小鼠內臟脂肪組織內提取前體細胞,通過感染 LV-Cre-GFP病毒和LV-GFP病毒,模擬基因敲除后向棕色脂肪細胞分化的過程。通過油紅染色鑒定脂肪細胞的形成和觀察脂肪細胞的形態(tài);3.應用實時熒光定量PCR(Real-time qPCR)技術檢測棕色脂肪細胞形成相關基因、線粒體標志基因及產熱基因表達的變化;應用Western Blot技術檢測細胞解偶聯(lián)蛋白UCP1的表達差異。以此來探索Dicer基因對小鼠白色脂肪棕色化影響的機制。結果1.與對照組小鼠相比,Dicer基因脂肪組織特異性敲除小鼠內臟脂肪含量減少(p0.005),小鼠糖代謝的能力也增強,兩組結果具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。2.實驗組小鼠內臟脂肪組織中脂肪細胞體積比對照組小鼠中的體積減小(p0.01),其UCP1基因表達增加,兩組結果具有統(tǒng)計學差異(p0.005)。3.Lentivirus-Cre-GFP病毒感染組細胞經棕色脂肪誘導液誘導成成熟的脂肪細胞后在形態(tài)上與對照組(Lentivirus-GFP感染組)無明顯差異,油紅染色均顯示有多房脂滴。進一步研究發(fā)現(xiàn)實驗組細胞與棕色脂肪分化相關的轉錄因子Prdm16、PGC-1α表達量明顯增高,產熱基因UCP-1和線粒體標記基因COX8b、COX4也明顯升高,且實驗組細胞 UCP-1蛋白水平表達量高于對照組,兩組數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學差異(p0.005)。結論Dicer基因脂肪特異性敲除可減少小鼠內臟脂肪含量,提高小鼠糖代謝水平。其作用機制可能是與Dicer基因調控白色脂肪前體細胞向棕色脂肪細胞分化有關。Dicer基因敲除促進內臟白色脂肪前體細胞棕色化,增加能量消耗,從而減輕內臟脂肪蓄積。
【圖文】：

攪拌，加熱，再加 57.1ml 醋酸，充分攪拌，，再加雙蒸水定容至 室溫保存。5.封閉液：1g 的 BSA+3ml 10% Triton+97ml PBS6.75%乙醇的配置：無水乙醇與雙蒸水 3 比 1 比例混合即可。7.2mg/ml I 型膠原酶的配置：100mg 膠原酶溶解于 50ml PBS 中，0.22um濾過，-20 度儲存?zhèn)溆�。．實驗方法（一）轉基因小鼠的構建(1).為研究Dicer基因對脂肪組織的影響，我們構建了脂肪組織Dicer基特異敲除小鼠Adiponectin-Cre；Dicerflox/flox和對照Dicerflox/flox小鼠，前者是脂組織中Dicer被敲除的實驗組小鼠，后者是沒有基因敲除的對照組小鼠。

結 果1．基因型鑒定結果如圖1所示，Adiponectin-Cre；Dicerflox/flox小鼠(KO) 和Dicerflox/flox小鼠(WT), DNA電泳條帶顯示如下,Cre條帶大約500bp左右,Dicer約400bp左右。圖1 實驗小鼠模型基因鑒定
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R589.2

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本文編號：2584082