【摘要】：背景:線粒體鈣離子攝入蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1,MICU1)是維持細(xì)胞線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的重要分子,MICU1對(duì)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)可能在糖尿病心肌病的發(fā)生及發(fā)展中起著重要作用,但目前機(jī)制尚不明確。目的:構(gòu)建MICU1基因的慢病毒表達(dá)載體,產(chǎn)毒感染H9C2細(xì)胞,評(píng)價(jià)MICU1基因在H9C2細(xì)胞中的表達(dá)效果,為后續(xù)在細(xì)胞水平研究糖尿病心肌病的發(fā)生及發(fā)展建立平臺(tái)。方法:PCR提取H9C2細(xì)胞MICU1基因,SpeⅠ、EcoRⅠ雙酶切后,將MICU1基因片段插入慢病毒載體pR RLsin.CMV.e FP中,構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pR RLsin.CMV.MICU1-e FP。使用pC MVDR8.91、pC MV-VSVG共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞中包裝產(chǎn)毒,用于感染H9C2細(xì)胞。通過(guò)RT-PCR及Western blot檢測(cè)感染后H9C2細(xì)胞中MICU1 m RNA及蛋白的表達(dá)。共聚焦顯微鏡檢測(cè)Rhod-2染色H9C2細(xì)胞后線粒體鈣水平。結(jié)果與結(jié)論:(1)MICU1基因成功插入pR RLsin.CMV.e FP慢病毒表達(dá)質(zhì)粒;(2)轉(zhuǎn)染pR RLsin.CMV.MICU1-e FP慢病毒表達(dá)質(zhì)粒后,可見(jiàn)293T細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白,并且MICU1的蛋白表達(dá)明顯升高;(3)病毒液感染H9C2細(xì)胞后,MICU1的蛋白及m RNA水平較未感染組及空質(zhì)粒包裝組明顯升高;(4)Rhod-2染色后觀察發(fā)現(xiàn),MICU1能夠明顯增強(qiáng)線粒體鈣水平;(5)結(jié)果表明,pR RLsin.CMV.MICU1-e FP慢病毒能夠高效感染H9C2細(xì)胞,為構(gòu)建永生化細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。

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