【摘要】：目的：比較類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞(RA-FLS)與正常關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞遷移、侵襲能力,并檢測(cè)RA相關(guān)miRNAs在兩種細(xì)胞中表達(dá)水平的改變,為進(jìn)一步研究miRNAs在RA發(fā)病中的作用及尋找RA治療新的靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究對(duì)象：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞和正常人關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞方法：選擇類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞的細(xì)胞MH7A和正常人關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞HFLS用于實(shí)驗(yàn)研究。MH7A和HFLS細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度80%左右時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代,三代至六代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞活性。利用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并比較兩種細(xì)胞的遷移、侵襲能力。Trizol法分別提取兩組細(xì)胞的總RNA,并進(jìn)行RNA定量分析。按照SYBR(?)PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit(Takara,RR716)說明書進(jìn)行Poly(A)加尾反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄成cDNA。選定用于實(shí)驗(yàn)的miRNAs和內(nèi)參,查找miRNAs數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org),分別找到選定miRNAs的原始序列,并按照引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行引物設(shè)計(jì),合成擴(kuò)增miRNAs的引物。進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR),并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：培養(yǎng)的HFLS呈長(zhǎng)梭形、多角形,具有突起,細(xì)胞胞體較大,邊界不清晰,大小不均勻,MH7A為長(zhǎng)梭形,排列規(guī)則。臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)顯示兩種細(xì)胞的活細(xì)胞率均大于90%,符合實(shí)驗(yàn)要求。Transwell細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)顯示MH7A遷移、侵襲能力較HFLS明顯增強(qiáng)。選定相關(guān)的11種miRNAs用于實(shí)驗(yàn),分別為miR-132、-155、-203、-223、-124、-15a、-16、18a、-19a、-26a、-146a,RT-qPCR檢測(cè)miRNAs在兩種細(xì)胞中的表達(dá),與HFLS相比,MH7A細(xì)胞中miR-132、-155、-203、-223、-124的表達(dá)上調(diào),其相對(duì)表達(dá)量升高,分別為2.328倍、3.882倍、6.020倍、1.343倍和1.831倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中miR-203表達(dá)升高最為顯著；而miR-15a、-16、18a、-19a、-26a、-146a的表達(dá)下調(diào),其相對(duì)表達(dá)量降低,分別為0.625倍、0.367倍、0.742倍、0.602倍、0.533倍和0.424倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中miR-16表達(dá)降低最為顯著。結(jié)論：1.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞遷移、侵襲能力較正常關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞明顯增強(qiáng)。2.RA相關(guān)的11種miRNAs在MH7A和HFLS中表達(dá)不同。RA-FLS中miRNAs的表達(dá)差異,可能直接或間接地通過調(diào)控MMPs和炎性細(xì)胞因子的分泌,調(diào)節(jié)RA-FLS的遷移和侵襲,參與RA的發(fā)病機(jī)制,這可能成為RA的診斷、監(jiān)測(cè)及治療的新靶點(diǎn)。
【圖文】：

成極向分布，可見細(xì)胞集落。兩種細(xì)胞均具有成纖維樣細(xì)胞的特性，細(xì)胞呈梭逡逑形，長(zhǎng)滿時(shí)呈旋禍狀分布。與ＨＦＬＳ細(xì)胞相比，ＭＨ７Ａ細(xì)胞體積較小，樹突較少，少量呈圓逡逑形生長(zhǎng)，胞質(zhì)突起較少或較長(zhǎng)（圖２）。逡逑圖２．Ｈ化Ｓ和ＭＨ７Ａ細(xì)胞形態(tài)W．左圈為Ｈ化Ｓ細(xì)胞（Ｘ２００）．右圖為ＭＨ７Ａ細(xì)胞（Ｘ２００）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＨＦＬＳ邋ａｎｄ邋ＭＨ７Ａ．邋Ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ，邋ＨＦＬＳ邋（Ｘ邋２００）．邋Ｔｈｅ邋ｒｉｇｈｔ，邋ＭＨ７Ａ邋（Ｘ邋２００）．逡逑４．２邐ＭＨ７Ａ和Ｈ化Ｓ細(xì)胞的活性鑒定逡逑將ＨＦＬＳ和ＭＨ７Ａ細(xì)胞分別經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后，死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞呈拒染。細(xì)胞活逡逑力計(jì)算：活細(xì)胞率（％）＝活細(xì)胞的總數(shù)／（活細(xì)胞的總數(shù)＋死細(xì)胞的怠數(shù)）Ｘ邋１００。顯微鏡下進(jìn)逡逑行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，結(jié)果提示ＨＦＬＳ活細(xì)胞率為９２％，ＭＨ７Ａ活細(xì)胞率為９５％，均大于９０％，符逡逑合實(shí)驗(yàn)要求。逡逑４．３與ＨＦＬＳ細(xì)胞相比，ＭＨ７Ａ細(xì)胞迂移、侵襲能力顯著提高逡逑為了比較ＭＨ７Ａ與冊(cè)ＬＳ細(xì)胞遷移、侵襲能力，我們分別進(jìn)行Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)逡逑和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明ＭＨ７Ａ細(xì)胞穿過微孔膜的遷移能力較冊(cè)ＬＳ細(xì)胞明顯增逡逑強(qiáng)（戶＜０．０５）（圖３Ａ、Ｃ和Ｅ），ＭＨ７Ａ細(xì)胞的穿過Ｍａｔｒｉｇｅｌ膠的侵襲能力也較冊(cè)ＬＳ細(xì)胞明顯逡逑增強(qiáng)（圖３Ｂ、Ｄ和Ｅ）（b6＜０．０５）。逡

成極向分布，可見細(xì)胞集落。兩種細(xì)胞均具有成纖維樣細(xì)胞的特性，細(xì)胞呈梭逡逑形，長(zhǎng)滿時(shí)呈旋禍狀分布。與ＨＦＬＳ細(xì)胞相比，ＭＨ７Ａ細(xì)胞體積較小，樹突較少，少量呈圓逡逑形生長(zhǎng)，胞質(zhì)突起較少或較長(zhǎng)（圖２）。逡逑圖２．Ｈ化Ｓ和ＭＨ７Ａ細(xì)胞形態(tài)W．左圈為Ｈ化Ｓ細(xì)胞（Ｘ２００）．右圖為ＭＨ７Ａ細(xì)胞（Ｘ２００）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＨＦＬＳ邋ａｎｄ邋ＭＨ７Ａ．邋Ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ，邋ＨＦＬＳ邋（Ｘ邋２００）．邋Ｔｈｅ邋ｒｉｇｈｔ，邋ＭＨ７Ａ邋（Ｘ邋２００）．逡逑４．２邐ＭＨ７Ａ和Ｈ化Ｓ細(xì)胞的活性鑒定逡逑將ＨＦＬＳ和ＭＨ７Ａ細(xì)胞分別經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后，死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞呈拒染。細(xì)胞活逡逑力計(jì)算：活細(xì)胞率（％）＝活細(xì)胞的總數(shù)／（活細(xì)胞的總數(shù)＋死細(xì)胞的怠數(shù)）Ｘ邋１００。顯微鏡下進(jìn)逡逑行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，結(jié)果提示ＨＦＬＳ活細(xì)胞率為９２％，ＭＨ７Ａ活細(xì)胞率為９５％，均大于９０％，符逡逑合實(shí)驗(yàn)要求。逡逑４．３與ＨＦＬＳ細(xì)胞相比，ＭＨ７Ａ細(xì)胞迂移、侵襲能力顯著提高逡逑為了比較ＭＨ７Ａ與冊(cè)ＬＳ細(xì)胞遷移、侵襲能力，我們分別進(jìn)行Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)逡逑和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明ＭＨ７Ａ細(xì)胞穿過微孔膜的遷移能力較冊(cè)ＬＳ細(xì)胞明顯增逡逑強(qiáng)（戶＜０．０５）（圖３Ａ、Ｃ和Ｅ），，ＭＨ７Ａ細(xì)胞的穿過Ｍａｔｒｉｇｅｌ膠的侵襲能力也較冊(cè)ＬＳ細(xì)胞明顯逡逑增強(qiáng)（圖３Ｂ、Ｄ和Ｅ）（b6＜０．０５）。逡
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R593.22

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本文編號(hào)：2567324