發(fā)布時(shí)間：2019-10-22 15:52

【摘要】：目的:阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,以進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能減退為主要臨床表現(xiàn)。AD的特征性病理改變?yōu)棣?淀粉樣蛋白(amyloid protein,Aβ)在神經(jīng)細(xì)胞外沉積形成老年斑。Aβ是AD的主要致病因素。AD不僅是老年人常見的疾病,也是糖尿病(diabetes mellitus,DM)病人高發(fā)的疾病。這對糖尿病病人無疑是雪上添霜。因此,亟待弄清糖尿病病人高發(fā)AD的原因,找到干預(yù)措施�；谝韵聝蓚�(gè)事實(shí):(1)報(bào)道顯示,AD病人腦中極長鏈脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFA,≥C22)水平增加。VLCFA對神經(jīng)細(xì)胞具有脂毒性,可以導(dǎo)致細(xì)胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增多,氧化應(yīng)激增強(qiáng)。而氧化應(yīng)激是目前公認(rèn)的Aβ生成增多的重要機(jī)制之一。(2)糖尿病是糖脂代謝紊亂疾病。我們假設(shè),在糖尿病狀態(tài)下,脂代謝的紊亂會(huì)使腦中的VLCFA聚集,進(jìn)而引起氧化應(yīng)激,使Aβ異常生成增加,最終導(dǎo)致認(rèn)知障礙,糖尿病AD發(fā)生。為了證實(shí)此假設(shè),本實(shí)驗(yàn)用高脂飲食加小劑量STZ的方法誘導(dǎo)2型糖尿病的大鼠模型,觀察2型糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶情況,以及腦中Aβ的生成、氧化應(yīng)激水平和VLCFA的變化,探討VLCFA在2型糖尿病大鼠腦Aβ生成中的作用,為預(yù)防及治療糖尿病AD提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以本實(shí)驗(yàn)室侯連國等人制備的2型糖尿病大鼠的腦組織為實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對照組(Con)和2型糖尿病組(DM)。2 Morris水迷宮檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力用上海吉量軟件科技有限公司Morris水迷宮,采用定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn),分別記錄大鼠的平均逃避潛伏期、穿越原平臺位置的次數(shù)和第一次到達(dá)原平臺的時(shí)間,以評估大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。3 ELISA檢測腦組織Aβ40、BACE1的含量用日本IBL公司ELISA試劑盒進(jìn)行測定,腦Aβ40的含量以pg/mg protein表示;腦BACE1的含量以ng/μg protein表示。4實(shí)時(shí)定量PCR檢測腦APP和BACE1的m RNA表達(dá)用美國OMEGA公司總RNA提取試劑盒提取大鼠腦組織總RNA。以18S r RNA做內(nèi)參,實(shí)時(shí)定量PCR測定APP、BACE1 m RNA的相對表達(dá)量。5免疫組織化學(xué)分析腦組織APP的蛋白水平對大鼠腦組織石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,分析APP的蛋白表達(dá)水平。6氣相色譜分析腦組織VLCFA提取各組大鼠腦組織脂肪酸,用日本島津公司氣相色譜儀(GC-2010 Plus)分析每種VLCFA的含量。7 TBA法測定腦組織丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法進(jìn)行測定,腦MDA的含量以nmol/mg prot表示。8 Western blot檢測NOX4,p47和HO-1的蛋白表達(dá)提取大鼠腦組織總蛋白,Western blot測定NOX4,p47和HO-1蛋白的相對表達(dá)量。9數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,對測定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性與方差齊性檢驗(yàn),數(shù)據(jù)用`x±SD表示。逃避潛伏期數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析(One-way repeated measures ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),其它數(shù)據(jù)采用Student’s t檢驗(yàn)分析兩組之間均數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1 DM大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降與Con組相比,雖然DM組大鼠第一天的逃避潛伏期有所延長,但隨后幾天均沒有明顯差異。DM組大鼠,與Con組相比,穿越原平臺次數(shù)明顯減少,第一次到達(dá)原平臺時(shí)間明顯延長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。表明,2型糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降。2 DM大鼠腦中Aβ生成增加2.1腦組織Aβ的含量ELISA結(jié)果顯示,Con組和DM組大鼠腦組織Aβ40含量分別為:Con(4.87±0.71 pg/mg protein),DM(6.22±0.81 pg/mg protein)。DM組腦組織Aβ含量較Con組明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。表明,糖尿病大鼠腦Aβ水平增加。2.2腦組織APP的表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,DM組腦組織APP m RNA的表達(dá)水平(0.046±0.014)較Con組(0.025±0.007)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。免疫組化結(jié)果顯示,DM組腦組織中APP陽性細(xì)胞數(shù)量、著色深度較Con組明顯增加;圖像分析顯示,DM組大鼠腦中APP陽性細(xì)胞的平均光密度值較Con組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。表明,糖尿病大鼠腦APP的m RNA和蛋白表達(dá)均增加。2.3腦組織BACE1的表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,DM組腦組織BACE1 m RNA的表達(dá)水平(0.912±0.038)較Con組(0.661±0.118)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。ELISA結(jié)果顯示,DM組腦組織BACE1的含量(0.95±0.09 ng/μg protein)較Con組(0.78±0.06 ng/μg protein)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。表明,糖尿病大鼠腦BACE1的m RNA和蛋白表達(dá)均增加。以上結(jié)果表明,糖尿病大鼠腦中APP的β-分泌酶裂解途徑上調(diào),從而導(dǎo)致Aβ生成增加,出現(xiàn)類似AD的病理改變。3 DM大鼠腦中C26:0水平增加氣相色譜結(jié)果顯示,DM組C26:0水平(44.90±13.94μmol/g tissue)較Con組(18.38±6.29μmol/g tissue)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);C22:0、C24:0含量在DM組與Con組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明,糖尿病大鼠腦極長鏈脂肪酸C26:0水平增加。4 DM大鼠腦中C26:0水平與Aβ含量呈正相關(guān)相關(guān)分析結(jié)果顯示,腦組織C26:0水平與Aβ含量呈正相關(guān)(r=0.557,P=0.016)。表明,糖尿病大鼠腦C26:0水平增加與Aβ生成增加有關(guān)。5 DM大鼠腦氧化應(yīng)激增強(qiáng)TBA結(jié)果顯示,DM組腦組織MDA的含量(2.19±0.27 nmol/mg protein)較Con組(1.83±0.19 nmol/mg protein)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示,DM組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)NOX4,p47和HO-1的蛋白表達(dá)水平均高于Con組。表明,糖尿病大鼠腦氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)。6 DM大鼠腦中C26:0水平與MDA含量呈正相關(guān)相關(guān)分析結(jié)果顯示,腦組織C26:0水平與MDA含量呈正相關(guān)(r=0.504,P=0.033)。表明,糖尿病大鼠腦C26:0水平增加與氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)有關(guān)。結(jié)論:1 2型糖尿病大鼠的認(rèn)知功能障礙與腦中C26:0增加所引起的Aβ增加有關(guān)。2 Aβ的增加與氧化應(yīng)激引起的APP和BACE1的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Mario Barbagallo;Ligia J Dominguez;;Type 2 diabetes mellitus and Alzheimer's disease[J];World Journal of Diabetes;2014年06期

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本文編號：2551712