【摘要】：目的:阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種慢性神經系統(tǒng)退行性疾病,以進行性記憶和認知功能減退為主要臨床表現。AD的特征性病理改變?yōu)棣?淀粉樣蛋白(amyloid protein,Aβ)在神經細胞外沉積形成老年斑。Aβ是AD的主要致病因素。AD不僅是老年人常見的疾病,也是糖尿病(diabetes mellitus,DM)病人高發(fā)的疾病。這對糖尿病病人無疑是雪上添霜。因此,亟待弄清糖尿病病人高發(fā)AD的原因,找到干預措施�；谝韵聝蓚�事實:(1)報道顯示,AD病人腦中極長鏈脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFA,≥C22)水平增加。VLCFA對神經細胞具有脂毒性,可以導致細胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)產生增多,氧化應激增強。而氧化應激是目前公認的Aβ生成增多的重要機制之一。(2)糖尿病是糖脂代謝紊亂疾病。我們假設,在糖尿病狀態(tài)下,脂代謝的紊亂會使腦中的VLCFA聚集,進而引起氧化應激,使Aβ異常生成增加,最終導致認知障礙,糖尿病AD發(fā)生。為了證實此假設,本實驗用高脂飲食加小劑量STZ的方法誘導2型糖尿病的大鼠模型,觀察2型糖尿病大鼠的學習記憶情況,以及腦中Aβ的生成、氧化應激水平和VLCFA的變化,探討VLCFA在2型糖尿病大鼠腦Aβ生成中的作用,為預防及治療糖尿病AD提供新的實驗依據。方法:1實驗動物以本實驗室侯連國等人制備的2型糖尿病大鼠的腦組織為實驗材料。實驗動物分為對照組(Con)和2型糖尿病組(DM)。2 Morris水迷宮檢測大鼠的學習記憶能力用上海吉量軟件科技有限公司Morris水迷宮,采用定位航行試驗和空間探索試驗,分別記錄大鼠的平均逃避潛伏期、穿越原平臺位置的次數和第一次到達原平臺的時間,以評估大鼠的學習記憶能力。3 ELISA檢測腦組織Aβ40、BACE1的含量用日本IBL公司ELISA試劑盒進行測定,腦Aβ40的含量以pg/mg protein表示;腦BACE1的含量以ng/μg protein表示。4實時定量PCR檢測腦APP和BACE1的m RNA表達用美國OMEGA公司總RNA提取試劑盒提取大鼠腦組織總RNA。以18S r RNA做內參,實時定量PCR測定APP、BACE1 m RNA的相對表達量。5免疫組織化學分析腦組織APP的蛋白水平對大鼠腦組織石蠟切片進行免疫組織化學染色,分析APP的蛋白表達水平。6氣相色譜分析腦組織VLCFA提取各組大鼠腦組織脂肪酸,用日本島津公司氣相色譜儀(GC-2010 Plus)分析每種VLCFA的含量。7 TBA法測定腦組織丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法進行測定,腦MDA的含量以nmol/mg prot表示。8 Western blot檢測NOX4,p47和HO-1的蛋白表達提取大鼠腦組織總蛋白,Western blot測定NOX4,p47和HO-1蛋白的相對表達量。9數據處理實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析,對測定結果進行正態(tài)性與方差齊性檢驗,數據用`x±SD表示。逃避潛伏期數據采用重復測量的方差分析(One-way repeated measures ANOVA)進行統(tǒng)計,其它數據采用Student’s t檢驗分析兩組之間均數的統(tǒng)計學差異。以P0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。結果:1 DM大鼠的學習記憶能力下降與Con組相比,雖然DM組大鼠第一天的逃避潛伏期有所延長,但隨后幾天均沒有明顯差異。DM組大鼠,與Con組相比,穿越原平臺次數明顯減少,第一次到達原平臺時間明顯延長,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。表明,2型糖尿病大鼠的學習記憶能力下降。2 DM大鼠腦中Aβ生成增加2.1腦組織Aβ的含量ELISA結果顯示,Con組和DM組大鼠腦組織Aβ40含量分別為:Con(4.87±0.71 pg/mg protein),DM(6.22±0.81 pg/mg protein)。DM組腦組織Aβ含量較Con組明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。表明,糖尿病大鼠腦Aβ水平增加。2.2腦組織APP的表達實時定量PCR結果顯示,DM組腦組織APP m RNA的表達水平(0.046±0.014)較Con組(0.025±0.007)明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。免疫組化結果顯示,DM組腦組織中APP陽性細胞數量、著色深度較Con組明顯增加;圖像分析顯示,DM組大鼠腦中APP陽性細胞的平均光密度值較Con組顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。表明,糖尿病大鼠腦APP的m RNA和蛋白表達均增加。2.3腦組織BACE1的表達實時定量PCR結果顯示,DM組腦組織BACE1 m RNA的表達水平(0.912±0.038)較Con組(0.661±0.118)明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。ELISA結果顯示,DM組腦組織BACE1的含量(0.95±0.09 ng/μg protein)較Con組(0.78±0.06 ng/μg protein)明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。表明,糖尿病大鼠腦BACE1的m RNA和蛋白表達均增加。以上結果表明,糖尿病大鼠腦中APP的β-分泌酶裂解途徑上調,從而導致Aβ生成增加,出現類似AD的病理改變。3 DM大鼠腦中C26:0水平增加氣相色譜結果顯示,DM組C26:0水平(44.90±13.94μmol/g tissue)較Con組(18.38±6.29μmol/g tissue)顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.001);C22:0、C24:0含量在DM組與Con組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明,糖尿病大鼠腦極長鏈脂肪酸C26:0水平增加。4 DM大鼠腦中C26:0水平與Aβ含量呈正相關相關分析結果顯示,腦組織C26:0水平與Aβ含量呈正相關(r=0.557,P=0.016)。表明,糖尿病大鼠腦C26:0水平增加與Aβ生成增加有關。5 DM大鼠腦氧化應激增強TBA結果顯示,DM組腦組織MDA的含量(2.19±0.27 nmol/mg protein)較Con組(1.83±0.19 nmol/mg protein)明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Western blot結果顯示,DM組大鼠腦組織氧化應激指標NOX4,p47和HO-1的蛋白表達水平均高于Con組。表明,糖尿病大鼠腦氧化應激水平增強。6 DM大鼠腦中C26:0水平與MDA含量呈正相關相關分析結果顯示,腦組織C26:0水平與MDA含量呈正相關(r=0.504,P=0.033)。表明,糖尿病大鼠腦C26:0水平增加與氧化應激水平增強有關。結論:1 2型糖尿病大鼠的認知功能障礙與腦中C26:0增加所引起的Aβ增加有關。2 Aβ的增加與氧化應激引起的APP和BACE1的表達上調有關。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1

【參考文獻】

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1 Mario Barbagallo;Ligia J Dominguez;;Type 2 diabetes mellitus and Alzheimer's disease[J];World Journal of Diabetes;2014年06期

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本文編號：2551712