【摘要】：研究目的本實(shí)驗(yàn)通過培養(yǎng)及鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,檢測其在s FRP3及Wnt5a等因素干預(yù)下,堿性磷酸酶、胞膜上的卷曲蛋白(Frizzled)及胞內(nèi)的β-catenin蛋白含量的變化,來探究s FRP3能否促進(jìn)BMSCs成骨分化及是否通過Wnt信號通路影響間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化,從而為治療骨質(zhì)疏松提供新的理論及方法。研究方法取4-6周齡大鼠股骨和脛骨骨髓腔內(nèi)骨髓單個核細(xì)胞,并通過多次換液及BMSCs的細(xì)胞貼壁特性進(jìn)行純化。利用DMEM培養(yǎng)基對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng),并利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。將傳代好的第三代細(xì)胞進(jìn)行凍存。首先我們采用MTT法研究s FRP3及Wnt5a對鼠BMSCs增殖的影響。通過在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值,觀察s FRP3及Wnt5a對細(xì)胞增殖的影響。接著我們研究不同濃度的s FRP3及Wnt5a對大鼠BMSCs成骨分化的影響。處理組細(xì)胞加入不同濃度的s FRP3及Wnt5a作為刺激因子,設(shè)立空白對照組,并進(jìn)行成骨誘導(dǎo),于第6天進(jìn)行堿性磷酸酶染色,利用ELASA檢測法,檢測細(xì)胞胞漿中堿性磷酸酶的水平。隨后我們研究s FRP3是否通過Wnt信號通路促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化。將1n M s FRP3、1n MWnt5a及1n M s FRP3+1n MWnt5a分別加入細(xì)胞孔板中,并設(shè)立對照組,進(jìn)行成骨誘導(dǎo),同樣利用ELASA檢測法,檢測細(xì)胞胞漿中堿性磷酸酶的水平。并提取各組的細(xì)胞的總蛋白,利用Western blot檢測各組細(xì)胞特異性抗體卷曲蛋白(Frizzled)及β-catenin的含量。結(jié)果1.s FRP3及Wnt5a對大鼠BMSCs增殖有抑制作用,隨濃度的增加,抑制作用增強(qiáng),細(xì)胞數(shù)目減少。2.與對照組對比,隨s FRP3濃度的增加,細(xì)胞胞漿中堿性磷酸酶水平逐漸增加,各組之間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.與對照組對比,隨Wnt5a濃度的增加,細(xì)胞胞漿中堿性磷酸酶水平逐漸降低,各組之間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。4.對1n M s FRP3、1n MWnt5a、1n M s FRP3+1n MWnt5a及空白對照組中細(xì)胞胞漿中堿性磷酸酶水平進(jìn)行檢測,s FRP3組s FRP3+1n MWnt5a組空白對照組Wnt5a組,各組之間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。5.對1n M s FRP3、1n MWnt5a、1n M s FRP3+1n MWnt5a及空白對照組中胞膜上的卷曲蛋白(Frizzled)及胞內(nèi)的β-catenin蛋白進(jìn)行Western blot檢測并進(jìn)行半定量分析,根據(jù)蛋白電泳條帶從深到淺排列,其順序?yàn)閟 FRP3組、空白對照組、s FRP3+1n MWnt5a組、Wnt5a組。結(jié)論1.s FRP3及Wnt5a抑制大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞增殖。2.s FRP3能促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,并促進(jìn)堿性磷酸酶的表達(dá),相反Wnt5a抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,并抑制堿性磷酸酶的表達(dá)。3.s FRP3抑制Wnt5a從而促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,并促進(jìn)堿性磷酸酶的表達(dá)。4.s FRP3抑制Wnt5a引發(fā)的非經(jīng)典的Wnt信號通路,從而促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。
【圖文】：

圖 1 經(jīng)典的與非經(jīng)典的 Wnt 信號通路相互影響Yamada 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，通過骨誘導(dǎo)，sFRP3 和 SFRP4 具有調(diào)節(jié)骨間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化的潛力，其中 SFRP4 主要參與經(jīng)典 Wnt 信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)成骨分化，而 sFRP3 則通過非經(jīng)典 Wnt 信號通路調(diào)節(jié)成骨分化。在體外 pull-down實(shí)驗(yàn)顯示 sFRP3 與 Wnt5a 相關(guān)聯(lián)�；谝陨涎芯�，我們設(shè)想 sFRP3 通過與 Wnt5a蛋白結(jié)合，從而抑制非經(jīng)典 Wnt/β-catenin 信號通路，經(jīng)典的 Wnt/β-catenin 信號通路受到的抑制作用得到減輕，最終促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化（圖 2）。圖 2 設(shè)想 sFRP3 作用于 Wnt 信號通路示意圖研究目的、方法

BMSCs 成骨分化及是否通過 Wnt/β-catenin 信號通路影響間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，從而為治療骨質(zhì)疏松提供新的理論及方法。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計主要由三部分組成，，第一部分主要驗(yàn)證檢測其在不同濃度 sFRP3及 Wnt5a 對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響。將不同濃度 sFRP3 及 Wnt5a 分別干預(yù)鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用 MTT 法，通過在酶標(biāo)儀測定各孔光吸收值，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增長曲線。第二部分主要驗(yàn)證 sFRP3 及 Wnt5a 能否促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。將不同濃度 sFRP3 及 Wnt5a 分別干預(yù)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，設(shè)立對照組，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，利用 ELASA 檢測法，檢測細(xì)胞胞漿中堿性磷酸酶的水平，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。第三部分主要驗(yàn)證 sFRP3 及 Wnt5a 的關(guān)系及 sFRP3 是否通過 Wnt/β-catenin信號通路影響大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。將 sFRP3、Wnt5a 及 sFRP3+Wnt5a分別干預(yù)細(xì)胞，設(shè)立對照組，利用 ELASA 檢測法，檢測細(xì)胞胞漿中堿性磷酸酶的水平，利用 Western blot 檢測胞膜上的卷曲蛋白（Frizzled）及胞內(nèi)的 β-catenin蛋白含量的變化，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析（圖 3）。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R580

【參考文獻(xiàn)】

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1 徐練;孔清泉;;調(diào)控成骨細(xì)胞分化及骨形成關(guān)鍵信號通路的研究進(jìn)展[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2014年12期

本文編號：2547799