【摘要】：背景/目的:骨質(zhì)疏松是一種以骨量減少和骨組織破壞為特征并可引起骨折的常見病。隨著我國人口老齡化的加劇,該病的患病人數(shù)越來越多,給病人和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。雖然其治療方法較多,但目前最主要的還是藥物治療,如補(bǔ)鈣,雌激素替代療法等。然而,當(dāng)前治療骨質(zhì)疏松的大多數(shù)藥物的療效并不理想,其原因在于這些藥物主要是通過抑制骨的重吸收來提高骨密度,卻難以促進(jìn)骨的形成。因此,發(fā)現(xiàn)促進(jìn)骨形成的新靶點(diǎn)、研發(fā)刺激骨合成的新型藥物已經(jīng)迫在眉睫。為深入探索促進(jìn)骨形成的新途徑,本課題主要篩選針對(duì)泛素連接酶Smurf1的小分子抑制劑,它可能會(huì)通過促進(jìn)BMP通路來刺激骨形成,為后續(xù)研發(fā)骨形成促進(jìn)劑類藥物奠定基礎(chǔ)。該類藥物有望恢復(fù)丟失的骨量,大幅度提高骨密度,降低骨折發(fā)生率,對(duì)于防治骨質(zhì)疏松具有重要意義。方法:我們首先利用計(jì)算機(jī)篩選技術(shù)得到了24個(gè)候選化合物。然后通過ALP活性檢測實(shí)驗(yàn)和Western Blot技術(shù)對(duì)購買的上述候選化合物進(jìn)行實(shí)體篩選,得到了效果最好的兩個(gè)化合物,其編號(hào)分別為B06和B75。接著又進(jìn)行了ALP染色和WST-1細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測等多種實(shí)驗(yàn),從細(xì)胞學(xué)水平和分子機(jī)制上對(duì)B06和B75號(hào)化合物都進(jìn)行了藥效評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。最后,采用Py MOL軟件將B06和B75號(hào)化合物分別與Smurf1 HECT結(jié)構(gòu)域的泛素結(jié)合區(qū)域進(jìn)行分子模擬對(duì)接,預(yù)測了它們的結(jié)合構(gòu)象,并對(duì)它們之間的相互作用進(jìn)行了初步分析。結(jié)果:初篩和復(fù)篩實(shí)驗(yàn)表明化合物B06和B75的綜合效果較好,可作為后續(xù)研究對(duì)象。濃度梯度實(shí)驗(yàn)和半衰期實(shí)驗(yàn)表明:隨上述化合物濃度的提高,Smad1/5的蛋白水平總體上呈明顯上升并趨于穩(wěn)定的狀態(tài);加入上述化合物后,隨時(shí)間的延長,Smad1/5的半衰期也有所延長。磷酸化實(shí)驗(yàn)和藥效對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明:上述化合物均能夠提高p-Smad1的蛋白水平;而在BMP通路激活時(shí)它們的藥效與MG132很接近。ALP染色和活性檢測實(shí)驗(yàn)表明上述化化合物能夠提高C2C12細(xì)胞中ALP的含量及活性。WST-1細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測實(shí)驗(yàn)表明:上述化合物能夠促進(jìn)C2C12細(xì)胞的增殖,且毒性較小。結(jié)論:綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)B06和B75號(hào)化合物不僅能通過抑制Smurf1與Ub的結(jié)合來提高并穩(wěn)定內(nèi)源性Smad1/5的蛋白水平,進(jìn)而促進(jìn)BMP信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,而且還能顯著增強(qiáng)C2C12細(xì)胞的成骨分化能力和細(xì)胞增殖能力。另外,計(jì)算機(jī)篩選的有關(guān)信息和分子模擬對(duì)接的圖像分析表明上述兩種化合物與Smurf1 HECT結(jié)構(gòu)域的泛素結(jié)合區(qū)域之間結(jié)合的都比較牢固,且構(gòu)象對(duì)接良好。因此相對(duì)其他實(shí)體候選化合物來說,化合物B06和B75的藥效更好,且有促進(jìn)骨形成的潛力。
【圖文】：

Smurf1 HECT 結(jié)構(gòu)域的小分子抑制劑的細(xì)胞學(xué)水平驗(yàn)前言(Introduction)Osteoporosis，OP)是一種以全身性骨量減少和骨組織微常見病[1]。按不同病因，OP 可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩絕經(jīng)后 OP 和老年性 OP，，而繼發(fā)性 OP 是由其他疾病所性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性骨髓瘤等。值得關(guān)見于絕經(jīng)后和老年人，但各年齡時(shí)期均可發(fā)病�；颊咄ㄍ吹龋∏閲�(yán)重時(shí)會(huì)發(fā)生髖部、椎體或橈骨遠(yuǎn)端等處有以下幾項(xiàng)病理表現(xiàn)：全身骨量減少，同時(shí)有皮質(zhì)骨和，骨小梁變細(xì)，體積變小和數(shù)量減少；骨髓腔擴(kuò)大，被質(zhì)和骨礦物質(zhì)含量均減少；骨細(xì)胞數(shù)量減少，空骨陷窩減少。

圖 1-1 正常骨組織與骨質(zhì)疏松后的骨組織變化[1]隨著老齡化社會(huì)的到來，骨質(zhì)疏松在世界范圍內(nèi)越來越流行，給患者和社會(huì)帶的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，50 歲以上的人群大約有 50%罹患骨質(zhì)疏松，而 80 歲約有 70%罹患骨質(zhì)疏松，且存在骨折風(fēng)險(xiǎn) OP 患者約占 40%的比例。我國每年松的治療需要投入大約 20 億美元。在美國，每年會(huì)新增加 1000 萬骨質(zhì)疏松斷與治療產(chǎn)生的費(fèi)用則高達(dá)每年 15 億美元，而且每年會(huì)新增 180 萬骨質(zhì)疏松險(xiǎn)人群[3-4]。毫無疑問，骨骼作為人體的一種器官，其生長發(fā)育離不開骨形成這兩方面的作用。在正常情況下，骨重塑是由成骨細(xì)胞（Osteoblast, OB）介導(dǎo)和破骨細(xì)胞（Osteoclast, OC）介導(dǎo)的骨吸收兩部分組成的，二者保持動(dòng)態(tài)平衡維持穩(wěn)定。而對(duì)骨質(zhì)疏松的患者來說，上述平衡被打破，導(dǎo)致了骨吸收大于骨況。但上述機(jī)制為人們治療骨質(zhì)疏松提供了兩大方向：促進(jìn)骨吸收和抑制骨
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R580

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 曾廣吾;;抗骨質(zhì)疏松治療的研究進(jìn)展[J];右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年01期

本文編號(hào)：2528875