【摘要】：人體蛋白一旦發(fā)生淀粉樣變性,容易誘發(fā)多種神經退行性疾病,如阿茲海默病、帕金森病、瘋牛病、家族性血管淀粉樣變性病、溶菌酶淀粉樣變性病等等。所謂淀粉樣變性主要是指蛋白質出現(xiàn)錯誤折疊或者部分降解,最終形成了不溶于血漿的淀粉樣纖維。它們能對人體泌尿、神經、心血管等系統(tǒng)造成損害,引發(fā)多種疾病。也有研究表明,與疾病不相關的蛋白質如胰島素,在一定的條件下也能轉化成淀粉樣纖維�？梢�,淀粉樣纖維化是所有蛋白質的共性。蛋白質的淀粉樣纖維化過程是一個成核依賴過程。在這一過程中,蛋白單體首先組合成具有部分折疊結構的中間體,再轉化為成核寡聚體。成核寡聚體進一步生長成為原纖維,原纖維通過彼此間相互聚集最終形成大分子的成熟纖維。本文以牛胰島素(Bovine Insulin,簡稱BI)和雞蛋清溶菌酶(Lysozyme,簡稱LYS)為體外研究模型,探索酚類物質及纖維種子在蛋白質淀粉樣纖維化過程中產生的影響,以及它們的作用機理。主要過程包括：從酚類物質中篩選抑制劑；從是否形成共價鍵,是否轉化為醌式結構的角度探究抑制劑的作用機理；研究纖維種子對淀粉樣纖維化過程的影響；分析纖維種子促進作用的原理；探究不同抑制劑存在下纖維種子能否發(fā)揮促進作用。主要實驗方法和結果：1.牛胰島素、溶菌酶淀粉樣生長檢測采用ThT(硫黃素T,Thioflavine T)熒光分析、ANS(8-苯胺基-1-萘磺酸,8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid)熒光分析、透射電子顯微鏡(TEM)技術檢測牛胰島素和溶菌酶在淀粉樣纖維化進程中熒光強度和形態(tài)的改變。ThT能與蛋白中的p-折疊特異性結合,反映蛋白質淀粉樣纖維化過程中p-折疊結構的變化情況。ANS能夠與蛋白質疏水區(qū)域進行特異性結合,反映出纖維化過程中疏水區(qū)的暴露情況。結果表明,牛胰島素和溶菌酶的纖維化過程中都伴隨著p-折疊結構的不斷增加和疏水區(qū)的逐漸暴露,其ThT生長曲線均呈“S”型外觀,經歷成核、生長、成熟三個動力學階段。在透射電鏡下孵育3天的牛胰島素外形呈球形小顆粒狀,孵育4天的牛胰島素呈現(xiàn)出稀疏、有分支的短鏈,孵育7天的牛胰島素和孵育12天的溶菌酶均為外觀粗壯、密集、無分支的直徑約5到35nm的長鏈。2.EGCG對蛋白質纖維化過程和成熟纖維的影響及機理探究通過ThT熒光分析篩選出同濃度的四種茶多酚中EGCG(表沒食子兒茶精-3-五倍子酸,Epigallocatechin Gallate)對蛋白質的淀粉樣纖維化過程的抑制作用最強,同時EGCG還對成熟的淀粉樣纖維有破壞作用。通過MALDI-TOF質譜分析發(fā)現(xiàn)被EGCG作用的樣品分子離子峰的質荷比大于純牛胰島素,其差值剛好為EGCG的相對分子質量減去一個氫原子的相對原子質量。表明EGCG與牛胰島素發(fā)生了共價結合。將EGCG修飾后的蛋白進行電泳、電轉分析,并配合巰基試劑DTT(二硫蘇糖醇,Dithiothreitol)、NEM(N-乙基順丁烯二酰亞胺,N-Ethylmaleimide)的運用,判斷修飾在蛋白上的EGCG的形態(tài)及作用位點。結果表明EGCG是以蛋白上的巰基為作用位點對蛋白進行修飾,同時EGCG自身轉化為了醌式結構。3.常見酚類物質和對苯醌對蛋白質纖維化過程的影響及機理探究采用ThT熒光分析、ANS熒光分析確定了鄰苯二酚、對苯二酚、對苯醌對蛋白質淀粉樣纖維化過程能起到抑制作用。通過電轉分析發(fā)現(xiàn)鄰苯二酚、對苯二酚、對苯醌在堿性條件下能被NBT染成紫色,說明鄰苯二酚和對苯二酚都已轉換為了相應的醌類物質。四種常見的酚類物質中只有鄰苯二酚和對苯二酚因其特殊結構能夠進一步轉化為鄰苯醌和對苯醌。而多酚類物質只有轉化成了醌類物質才能對蛋白質的淀粉樣纖維化過程產生抑制。4.纖維種子對蛋白質纖維化過程的影響把孵育成熟的淀粉樣纖維,在37℃的條件下進行超聲,使纖維被徹底打碎,打碎后的纖維即可作為纖維種子加入其他樣品中進行孵育。實驗證明,纖維種子類似于纖維化過程中的原纖維狀態(tài),其余蛋白質可迅速在原纖維的基礎上聚集、生長,在極短的時間內,長成成熟的纖維。把纖維化中、后期的蛋白樣品在37℃的條件下進行超聲破碎,加入未孵育的蛋白中,仍然可以起到纖維種子的作用,加速蛋白質的淀粉樣纖維化。不過纖維種子對蛋白質纖維化的促進能力與纖維種子自身的纖維化程度有關。纖維種子的纖維化程度越高,促進作用越明顯。5.纖維種子和EGCG對蛋白質纖維化過程的影響在牛胰島素中同時加入EGCG和纖維種子進行孵育,通過ThT熒光分析發(fā)現(xiàn),在0-2天時,同時加入EGCG和纖維種子的樣品熒光強度高于純牛胰島素樣品和只加入EGCG的樣品,但明顯小于只加入纖維種子的樣品。從第3天開始,同時加入EGCG和纖維種子的樣品熒光強度逐漸降低,在第7天時和只加入EGCG的樣品熒光強度幾乎相同。通過透射電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)纖維種子和EGCG共存的樣品在第7天時牛胰島素并未形成完整的纖維,仍為稀疏的短鏈,不過比只加入EGCG的樣品形成的纖維稍粗壯一些。故在纖維生長的前期纖維種子和EGCG共同發(fā)揮了作用,纖維生長的中后期主要是EGCG發(fā)揮其抑制作用。由于EGCG對蛋白的破壞作用是不可逆的,在EGCG存在的條件下即使加入纖維種子,最終也難以形成成熟的纖維。6.PEG對蛋白質纖維化過程的影響PEG(聚乙二醇,Polyethylene Glycol)在溶液中能形成一種擁擠的環(huán)境,其濃度越大,對蛋白起到的分散作用就越明顯。蛋白間的相互聚集受到阻礙而難以形成纖維,故PEG對蛋白質纖維化過程能起到一定的抑制作用。PEG作用后的樣品在任意時刻加入纖維種子,ThT熒光強度立刻增強。這是由于PEG只能把蛋白質的纖維化抑制在原纖維階段,一旦加入纖維種子,蛋白就能在纖維種子的表面聚集、生長,迅速長成成熟的纖維。結論：綜合實驗結果可知,牛胰島素和溶菌酶在一定的條件下均能形成淀粉樣纖維,其生長曲線均呈“S”形。EGCG、鄰苯二酚和對苯二酚能抑制蛋白質淀粉樣纖維化過程,破壞成熟的淀粉樣纖維,其機理都是酚類物質轉化為相應的醌式結構與蛋白質的巰基發(fā)生了共價結合。纖維種子的存在能大大加速蛋白質淀粉樣纖維化進程。當纖維種子與EGCG同時存在時,纖維生長的前期EGCG和纖維種子共同發(fā)揮作用,纖維生長的中后期,則主要為EGCG發(fā)揮其抑制作用。PEG能在體系中營造一種擁擠的環(huán)境,將蛋白的濃度分散,使蛋白與蛋白間無法聚集。然而PEG只能把蛋白質的淀粉樣纖維化抑制在其原纖維的階段,在含PEG的體系中一旦加入纖維種子,蛋白就能在纖維種子的表面聚集、生長,迅速長成成熟的纖維。
【學位授予單位】：陜西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R597.2

【共引文獻】

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本文編號：2514891