【摘要】：千百年來,醫(yī)學(xué)不斷前進(jìn),尋求治療人類疾病的良方,探尋的腳步從未停歇。改善群眾的生活質(zhì)量、延長生命從來都是醫(yī)者的崇高使命。隨著經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展和工業(yè)化的進(jìn)程,生活方式的轉(zhuǎn)變以及老齡化進(jìn)程的加速,使得我國糖尿病的發(fā)病率正呈急劇上漲的趨勢(shì),成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的又一個(gè)嚴(yán)重危害群眾健康的重要的慢性非傳染性疾病。WHO估計(jì)2005-2015年間中國因?yàn)樘悄虿〖捌湎嚓P(guān)心血管疾病而致使的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)5577億美元。近些年的大量調(diào)查表明,不論是歐美發(fā)達(dá)國家亦是發(fā)展中國家,糖尿病的控制狀況都不大樂觀。長期以來,為抑制糖尿病病魔肆虐,國內(nèi)外同仁共同為防治糖尿病做著孜孜不倦的努力,開展了大量糖尿病宣傳教育、流行病學(xué)調(diào)查、防治研究、臨床以及基礎(chǔ)研究。全球范圍內(nèi)不斷涌現(xiàn)的新型降糖藥物,為防治糖尿病提供了更多的選擇。然而,不論是增加胰島素分泌還是改善胰島素敏感性,亦或是胰島素泵替代治療,大多局限于“胰島p細(xì)胞/胰島素”這個(gè)單一的靶點(diǎn),尚不能完全糾正糖尿病狀態(tài)下機(jī)體的病理生理紊亂,而且單純改善血糖控制水平并未帶來預(yù)期的獲益。因此,尋找糖尿病治療的新靶點(diǎn),對(duì)于糖尿病及其并發(fā)癥的控制具有重要意義。胰島α細(xì)胞數(shù)量占胰島細(xì)胞總量的15%-20%,其分泌的胰高血糖素是由29個(gè)氨基酸構(gòu)成的直鏈多肽,與胰島素作用相互拮抗,具備很強(qiáng)的促進(jìn)糖原分解和糖異生作用。胰高血糖素的分泌在很大程度上取決于胰島β細(xì)胞分泌的胰島素。正常情況下,餐后血糖升高會(huì)刺激β細(xì)胞分泌胰島素,而α細(xì)胞則會(huì)減少胰高血糖素的分泌；隨著血糖及胰島素水平的下降,胰高血糖素分泌增加而加強(qiáng)對(duì)肝糖的輸出,從而升高血糖。一般認(rèn)為,胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能紊亂是T2DM的主要病理生理學(xué)機(jī)制,而胰高血糖素在其中的作用考慮的很少。近年來,胰島α細(xì)胞上同樣被發(fā)現(xiàn)存在胰島素受體及其下游信號(hào)通路,并證明胰島素是經(jīng)過胰島素受體底物(I nsulin receptor substrate, IRS)-磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidyl inositol-3-kinase, PI3 K)途徑抑制胰島α細(xì)胞胰高血糖素的基因表達(dá)和釋放。α細(xì)胞膜上受體后胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損,致使胰高血糖素合成和分泌亢進(jìn)。因此,在糖尿病狀態(tài)下,胰島素分泌受損削弱對(duì)胰高血糖素分泌的抑制作用或α細(xì)胞的胰島素敏感性下降,胰高血糖素分泌出現(xiàn)不適當(dāng)上升。近年來,大量證據(jù)表明腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system,RAS)的過度激活參與了T2DM的發(fā)展,與此同時(shí),國外一些大規(guī)模人群臨床研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素受體阻斷劑(Angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockers, ARB)或血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Angiotensin-converting enzyme inhibitors, ACEI)治療顯著降低了高危人群中新診斷糖尿病的發(fā)生率,但其改善糖尿病的確切機(jī)制目前尚未完全闡明,可能與改善胰島素分泌及胰島素敏感性有關(guān)。經(jīng)典的系統(tǒng)RAS在調(diào)節(jié)血壓、水電質(zhì)平衡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用；此外,RAS的所有組分均被證實(shí)存在于腎上腺、肝、心臟、腦、神經(jīng)元、生殖器官、血管、骨骼肌、脂肪及胰島等許多組織中,即存在局部獨(dú)立的RAS,在局部的生理病理過程中起著重要的作用。因此,胰島局部RAS可能影響胰島功能。實(shí)際上,不管在體動(dòng)物研究還是離體動(dòng)物研究均表明,RAS可誘導(dǎo)胰島纖維化、氧化應(yīng)激以及炎癥的形成,并可削弱胰島素分泌,而RAS拮抗劑或ACEI拮抗劑處理后可改善胰島結(jié)構(gòu)及功能,并對(duì)糖耐量有一定改善。目前,關(guān)于胰島局部RAS的作用多集中于其對(duì)胰島β功能的影響,而胰島局部RAS對(duì)胰島α細(xì)胞功能的研究及其對(duì)胰高血糖素分泌改變有何影響?其相關(guān)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制如何?尚不清楚,目前國內(nèi)外相關(guān)資料甚少。當(dāng)前證據(jù)表明RAS通過介導(dǎo)胰島血流減少、胰島纖維化、氧化應(yīng)激和炎癥等而影響胰島素分泌以及其敏感性。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)ARB能顯著改善db/db糖尿病小鼠的糖耐量,減輕胰島素抵抗,并對(duì)胰島p細(xì)胞功能具有一定的改善作用,同時(shí)觀察到胰高血糖素分泌減少,但無法確定這些保護(hù)作用是源于胰島局部RAS阻斷還是全身RAS阻斷。血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, AT Ⅱ)作為RAS的最主要活性物質(zhì),需與靶器官或靶組織上的相應(yīng)受體即血管緊張素Ⅱ 1型受體(Angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1R)結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)作用。因此,本研究利用db/db小鼠為研究對(duì)象,觀察其胰島局部AT1R的表達(dá),通過腺病毒介導(dǎo)RNA干擾(RNAinterference, RNAi)特異性抑制胰島局部AT1R的表達(dá),觀察其對(duì)胰島素相關(guān)信號(hào)通路分子表達(dá)的影響,并利用胰島灌流評(píng)估其胰高血糖素及胰島素動(dòng)態(tài)分泌功能,探討其可能的作用機(jī)制,進(jìn)而揭示胰島局部RAS在內(nèi)分泌胰腺中的作用及與2型糖尿病的關(guān)系,為尋找糖尿病防治藥物的新作用靶點(diǎn)拓展新思路。具體研究分為以下三個(gè)部分：第一章 db/db糖尿病小鼠胰島局部血管緊張素Ⅱ1型受體的表達(dá)[目的]觀察db/db小鼠胰島局部AT1R的表達(dá),以進(jìn)一步揭示胰島局部RAS在胰高血糖素分泌功能中的作用。[方法]選取15只8周齡無特定病原體(SPF)級(jí)雌性C57BL/KsJ-db/db小鼠及15只同周齡同窩出生的C57BL/KsJ-db/m小鼠。分離培養(yǎng)db/db和db/m小鼠胰島,熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR) 及 Western blot檢測(cè)AT1RmRNA和蛋白的表達(dá)。[結(jié)果]db/db小鼠胰島AT1R mRNA及蛋白的表達(dá)水平均為db/m小鼠胰島的3倍左右,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[mRNA:(320±25)%vs(100±8)%, P0.05;蛋白：(310±20)%vs(100±8)%), P0.05]。[結(jié)論]db/db糖尿病小鼠胰島局部AT1R過度表達(dá)。第二章 db/db糖尿病小鼠胰島局部AT1R基因RNA干擾重組腺病毒的構(gòu)建[目的]構(gòu)建AT1R基因靶向RNAi重組腺病毒,并在293包裝細(xì)胞中擴(kuò)增制備重組病毒。[方法]由生物公司合成針對(duì)db/db小鼠AT1R mRNA的特異性小分子干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)真核表達(dá)質(zhì)粒psiRNA-ATIR;雙酶切得到siRNA-AT1R表達(dá)片段；插入pAdTrack載體上,獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrack-siRNA-AT1R;后者經(jīng)線性化處理后,轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組；Pac Ⅰ酶切鑒定,篩選出正確重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-siRNA-AT1R;酶切線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝成重組病毒Ad-siAT1R,熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá),行PCR鑒定。通過反復(fù)感染擴(kuò)增病毒,以氯化銫密度梯度離心法純化重組腺病毒。同法擴(kuò)增空載病毒Ad-siControl至相當(dāng)量,并純化。[結(jié)果]Pac Ⅰ酶切鑒定證實(shí)重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-siRNA-AT1R構(gòu)建成功；于熒光顯微鏡下觀察到pAdEasy-siRNA-AT1R轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后有綠色熒光蛋白表達(dá)；PCR鑒定說明重組腺病毒中含siRNA-AT1R片斷,成功構(gòu)建了攜帶含AT1R干擾RNA的重組腺病毒Ad-siAT1R,在293包裝細(xì)胞中擴(kuò)增后,利用氯化銫梯度離心純化法獲得約3.6×109 efu/ml滴度的重組腺病毒。[結(jié)論]利用A dEasy-1系統(tǒng)可快速高效制備表達(dá)AT1R干擾RNA的重組腺病毒,為進(jìn)一步研究胰島局部RAS在胰高血糖素分泌功能中的作用奠定了基礎(chǔ)。第三章 胰島灌流評(píng)估db/db小鼠胰島局部AT1R基因沉默后的胰高血糖素動(dòng)態(tài)分泌功能[目的]觀察AT1R基因靶向RNAi重組腺病毒對(duì)db/db小鼠胰島中AT1R表達(dá)以及IRS、PI3K調(diào)節(jié)亞基p85[PI3K(p85)]以及磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(p-Akt2)的表達(dá),并利用離體胰島灌流系統(tǒng)評(píng)估胰島素及胰高血糖素動(dòng)態(tài)分泌情況,探討其可能的機(jī)制。[方法]db/db小鼠胰島過夜培養(yǎng),分為3組處理：Ad-siAT1R組,按MOI 100,加入Ad-siAT1R病毒液,作用2小時(shí),更換新培養(yǎng)液；空病毒組：以不表達(dá)任何目的基因的腺病毒Ad-siControl用相同的MOI感染；空白對(duì)照組：同等條件下培養(yǎng)但未行任何干預(yù)處理的胰島。胰島繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),此后檢測(cè)/T1R、IRS-1、IRS-2、PI3K(p85)及p-Akt2表達(dá),并利用胰島灌流評(píng)估胰高血糖素及胰島素動(dòng)態(tài)分泌。[結(jié)果]1、與Ad-siControl組相比,Ad-siAT1R組AT1RmRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降；2. Ad-siAT1R組IRS-1、IRS-2、PI3K(p85)及p-Akt2蛋白表達(dá)水平Ad-siControl組均顯著上調(diào)；3、胰島灌流顯示Ad-siATIR組在高糖刺激1-2min后,胰島素分泌急劇上升達(dá)到高峰140 mU/L,為基礎(chǔ)水平的2.8倍,而其胰高血糖素分泌立即出現(xiàn)顯著性下降,達(dá)14pmol/L,與基礎(chǔ)值相比,下降13pmol/L;而Ad-siControl組在高糖刺激1-2min時(shí)胰島素分泌也出現(xiàn)一定程度的升高,峰值僅為90 mU/L,為基礎(chǔ)值的1.8倍,其胰高血糖素分泌逐漸下降至35pmol/L,僅比基礎(chǔ)值下降5pmol/L。[結(jié)論]RNAi技術(shù)特異性抑制胰島局部RAS顯著改善了db/db小鼠胰高血糖素的過度分泌情況,這可能得益于胰島素分泌增加導(dǎo)致的抑制作用增強(qiáng),但是否與α細(xì)胞胰島素敏感性相關(guān),有待采用a細(xì)胞株進(jìn)一步研究探明。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.1

【共引文獻(xiàn)】

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2 李娜;李峰;;GLP-1受體激動(dòng)劑和DPP-4抑制劑在糖尿病治療中的研究進(jìn)展[J];藥學(xué)研究;2015年08期

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本文編號(hào)：2502413