【摘要】：目的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種以慢性,進(jìn)行性,侵襲性外周關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫病。RA的病因及其發(fā)病機(jī)制仍是不完全清楚的。RA的主要病理特征為持續(xù)性關(guān)節(jié)滑膜炎和侵襲性血管翳形成,隨著病情的進(jìn)展,出現(xiàn)骨和軟骨的破壞,最終導(dǎo)致畸形甚至引起殘疾。血管新生是侵襲性血管翳形成的基礎(chǔ)。中性粒細(xì)胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)是中性粒細(xì)胞在適當(dāng)?shù)拇碳は?形成并釋放的由顆粒蛋白,抗菌肽等蛋白修飾的染色質(zhì)構(gòu)成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。已有研究報(bào)道NETs是RA患者的瓜氨酸化抗原的重要來源之一,推測NETs參與RA的發(fā)生發(fā)展。在慢性阻塞性肺疾病中,NETs可促進(jìn)肺部血管新生。血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A,SAA)是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SAA可以誘導(dǎo)NETs形成。本研究在以往的工作基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討了NETs在RA血管新生中的作用及SAA誘導(dǎo)NETs形成的分子機(jī)制。方法1.利用組織免疫熒光染色觀察RA,OA滑膜組織中NETs存在情況。2.利用密度梯度離心提取健康體檢者的外周血中性粒細(xì)胞,用LPS刺激誘導(dǎo)NETs形成,并提取NETs,應(yīng)用nanodrop分光光度計(jì)檢測DNA-NETs濃度。3.利用MTT實(shí)驗(yàn)分析NETs對體外培養(yǎng)的HUVECs增殖的影響。4.利用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)分析NETs對HUVECs遷移的影響。5.構(gòu)建體外血管形成的三維模型分析NETs對HUVECs管腔形成的影響。6.利用密度梯度離心法提取類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和健康體檢者的外周血中性粒細(xì)胞,提取得到的中性粒細(xì)胞進(jìn)行HE染色鑒定細(xì)胞純度,DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài)。7.提取得到的中性粒細(xì)胞分為RA組(8例)和HC組(13例),做以下處理:對照組,LPS刺激組及SAA刺激組,分別加入Tris-HCL緩沖液,LPS和SAA,刺激4h,DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察NETs形成。8.提取健康體檢者的外周血中性粒細(xì)胞,分為對照組,SAA組,(SAA+anti-TLR4-Ab)組,LPS組,(LPS+anti-TLR4-Ab)組和anti-TLR4-Ab組,加入相應(yīng)刺激劑處理4h后,收集上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞爬片免疫熒光染色后于熒光顯微鏡下觀察NETs形成。9.應(yīng)用Pico Green試劑盒檢測上清中DNA濃度。配制DNA標(biāo)準(zhǔn)液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,用于上清中DNA濃度計(jì)算。結(jié)果1.組織免疫熒光結(jié)果顯示與OA患者滑膜組織相比,RA患者滑膜組織NETs形成較多。2.熒光染色法觀察得到LPS可誘導(dǎo)NETs形成,且提取的DNA-NETs濃度為27.8mg/L/106細(xì)胞。3.MTT實(shí)驗(yàn)分析得到與對照組(0.405±0.445)相比,NETs刺激組(1.241±0.068)明顯促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞增殖(p0.05),在用DNaseⅠ處理NETs(0.919±0.056)后,NETs促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力明顯受到抑制(p0.05)。4.劃痕實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)與對照組(16.57±1.066%)相比,NETs可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移(78.43±1.784%),在用DNaseⅠ處理NETs(44.57±1.798%)后,NETs促進(jìn)HUVECs遷移的能力明顯受到抑制(p0.05)。5.體外血管形成的三維血管模型顯示,NETs可以促進(jìn)HUVECs節(jié)點(diǎn)的形成(2.857±0.3401 vs.1.143±0.4041,p0.05),用DNaseⅠ處理NETs后,該能力受到抑制(1.571±0.3689 vs.2.857±0.3401,p0.05)。6.HE染色顯示中性粒細(xì)胞純度達(dá)到95%以上,DAPI染色觀察到了中性粒細(xì)胞典型的桿狀核和分葉核形態(tài),提取的中性粒細(xì)胞純度及狀態(tài)都達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。7.鏡下計(jì)數(shù)結(jié)果顯示無論是SAA刺激組(19.10±0.7922%vs.14.67±1.078%,p0.05)或者是自發(fā)形成組(7.394±0.5270%vs.4.85±0.3659%,p0.05),RA組中性粒細(xì)胞比HC組中性粒細(xì)胞相對更易形成NETs,并且鏡下觀察發(fā)現(xiàn)形成的NETs更典型。8.結(jié)果顯示,SAA刺激組(14.58±1.058%)和LPS刺激組(13.70±0.794%)的形成NETs的百分率均明顯高于對照組(5.734±0.428%,p0.05),且在用中和抗體預(yù)處理后再行SAA刺激組(6.915±0.418%)的NETs形成百分率明顯低于SAA刺激組(14.58±1.058%,p0.05),(LPS+anti-TLR4 Ab)組(6.905±0.4646%)也明顯低于LPS刺激組(13.71±0.7951%,p0.05)。9.結(jié)果顯示,SAA刺激組(36.89±1.288μg/m L)和LPS刺激組(35.23±0.7689μg/m L)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的DNA濃度明顯高于對照組(12.65±0.8157μg/m L,p0.05)。在經(jīng)TLR4中和抗體預(yù)處理后行SAA刺激組(16.34±0.611μg/m L)上清DNA濃度明顯降低(p0.05)。(LPS+anti-TLR4-Ab)組(15.77±0.8893μg/m L)也明顯低于LPS刺激組(p0.05)。結(jié)論1.RA患者的中性粒細(xì)胞更易形成NETs。與OA滑膜組織相比,RA滑膜組織中存在更多的NETs。RA患者中性粒細(xì)胞處于預(yù)激活狀態(tài),其形成NETs的能力比健康對照組更強(qiáng)。2.NETs可促進(jìn)血管新生。NETs可明顯促進(jìn)HUVECs增殖,遷移和管腔形成,提示NETs可促進(jìn)血管新生。當(dāng)用DNaseⅠ分別預(yù)處理NETs后,NETs促進(jìn)血管新生的作用受到抑制,提示NETs中DNA在血管新生中發(fā)揮了重要作用。3.SAA可以通過與TLR4相互作用誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R593.22

【參考文獻(xiàn)】

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1 蘇慧慧;萬春友;魏蔚;孟海妹;焦亞沖;邢冬紅;鄭芳;;血清淀粉樣蛋白A誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成[J];天津醫(yī)藥;2016年02期

2 穆云;魏蔚;張福江;孫續(xù)國;劉弘毅;倪敏;鄭芳;;血清淀粉樣蛋白A在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)表達(dá)的研究[J];中華風(fēng)濕病學(xué)雜志;2011年11期

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本文編號：2498496