【摘要】：目的本文擬探討miR-32在高糖介導(dǎo)的VSMCs鈣化中的作用及機(jī)制,為闡明糖尿病血管鈣化的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1.為檢測(cè)高糖對(duì)血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響,以正常濃度葡萄糖(NG,5 mM)或高濃度葡萄糖(HG,25 mM)處理小鼠血管平滑肌細(xì)胞(MVSMCs),不加或者加鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)鈣化,1天和3天后通過qRT-PCR和/或Western Blot檢測(cè)平滑肌標(biāo)志物(SMA、SM-22和SM-MHC)、成骨標(biāo)志物(OCN、ALP和RUNX2)的表達(dá)水平,以及應(yīng)用分光光度法檢測(cè)ALP活性。30天后應(yīng)用茜素紅染色檢測(cè)MVSMCs鈣含量。2.為了檢測(cè)miR-32是否參與MVSMCs鈣化過程的調(diào)控,將pre-miR-32、anti-miR-32分別轉(zhuǎn)染入MVSMCs中,通過qRT-PCR檢測(cè)OCN、BMP-2、Runx2、OPN以及MGP的mRNA表達(dá)水平,應(yīng)用分光光度法檢測(cè)ALP活性,并測(cè)定鈣含量。3.MVSMCs分別在含5mmol/l及25mmol/l糖濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng),不加或者加鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)鈣化,1天和3天后通過qRT-PCR和/或Western Blot檢測(cè)miR-32、靶基因GATA6以及GATA6下游基因Grem1的表達(dá)水平;同時(shí),應(yīng)用熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GATA6對(duì)OCN啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果1.高糖對(duì)平滑肌細(xì)胞鈣化的影響:高糖誘導(dǎo)了MVSMCs鈣含量的增多,顯著增加了MVSMCs的成骨標(biāo)志物(ALP、OCN和RUNX2)的表達(dá)。此外,高糖降低了平滑肌標(biāo)志物(SMA、SM-22和SM-MHC)的表達(dá)水平。2.miR-32對(duì)平滑肌細(xì)胞鈣化的影響:pre-miR-32轉(zhuǎn)染入MVSMCs4天后,MVSMCs的BMP2、Runx2、OPN和MGP的mRNA水平明顯增加;過表達(dá)miR-32導(dǎo)致MVSMCs的ALP活性顯著增強(qiáng),以及MVSMCs鈣含量的明顯增加。而將anti-miR-32轉(zhuǎn)染入MVSMCs后,上述結(jié)果剛好相反。3.高糖誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞鈣化的可能機(jī)制:高糖顯著增加了MVSMCs的miR-32表達(dá)水平,相應(yīng)地降低了miR-32的靶基因—GATA6的mRNA和蛋白水平;我們還發(fā)現(xiàn)了高糖可降低Grem-1的表達(dá);熒光素酶實(shí)驗(yàn)則顯示GATA6可抑制OCN啟動(dòng)子活性。結(jié)論1.高糖可促進(jìn)小鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化。2.miR-32可在血管鈣化過程中發(fā)揮調(diào)控作用,能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的鈣化。3.高糖可通過誘導(dǎo)miR-32上調(diào)降低GATA6的表達(dá),并影響sm-MHC/OCN/Grem1信號(hào)網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)平滑肌細(xì)胞鈣化的發(fā)生。
[Abstract]:Objective to investigate the role and mechanism of miR-32 in high glucose mediated VSMCs calcification, and to provide experimental basis for the pathogenesis of diabetic vascular calcification. Method 1. In order to detect the effect of high glucose on calcification of vascular smooth muscle cells (VSMCs), mouse vascular smooth muscle cells (VSMCs) were treated with normal concentration of glucose (NG,5 mM) or high concentration of glucose (HG,25 mM) without adding or adding calcification medium to induce calcification. The expression of smooth muscle markers (SMA,SM-22 and SM-MHC) and osteogenic markers (OCN,ALP and RUNX2) were detected by qRT-PCR and / or Western Blot 1 and 3 days later. And the activity of ALP was detected by spectrophotometry. 30 days later, the calcium content of MVSMCs was detected by alizalin red staining. In order to detect whether miR-32 was involved in the regulation of MVSMCs calcification, pre-miR-32,anti-miR-32 was transfected into MVSMCs, and the mRNA expression levels of OCN,BMP-2,Runx2,OPN and MGP were detected by qRT-PCR. The activity of ALP was detected by spectrophotometry, and the calcium content was determined. 3. MVSMCs were cultured in the medium containing 5mmol/l and 25mmol/l sugar concentration, and calcification was induced by adding or adding calcification medium, respectively. One day and three days later, the expression levels of miR-32, target gene GATA6 and GATA6 downstream gene Grem1 were detected by qRT-PCR and / or Western Blot. At the same time, the effect of GATA6 on the activity of OCN promoter was detected by luciferase assay. Result 1. Effect of high glucose on calcification of smooth muscle cells: high glucose induced the increase of MVSMCs calcium content and significantly increased the expression of osteogenic markers (ALP,OCN and RUNX2) of MVSMCs. In addition, high glucose decreased the expression of smooth muscle markers (SMA,SM-22 and SM-MHC). Effect of miR-32 on calcification of smooth muscle cells: after pre-miR-32 transfer into MVSMCs4, MVSMCs BMP2,Runx2, The mRNA levels of OPN and MGP increased significantly. Overexpression of miR-32 resulted in a significant increase in ALP activity and MVSMCs calcium content in MVSMCs. After anti-miR-32 was transferred into MVSMCs, the above results were just the opposite. The possible mechanism of calcification induced by high glucose in smooth muscle cells: high glucose significantly increased the expression of miR-32 in MVSMCs and decreased the mRNA and protein levels of GATA6, the target gene of miR-32, and we also found that high glucose could decrease the expression of Grem-1. Luciferase assay showed that GATA6 could inhibit the activity of OCN promoter. Conclusion 1. High glucose can promote calcification of vascular smooth muscle cells in mice. 2.miR-32 can play a regulatory role in the process of vascular calcification and promote calcification of smooth muscle cells. High glucose can up-regulate the expression of GATA6 by inducing miR-32, and affect the sm-MHC/OCN/Grem1 signal network to promote the calcification of smooth muscle cells.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2

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本文編號(hào)：2484477