【摘要】：研究目的:甲狀腺相關(guān)性眼病是是眼眶病中較常見的一種,且發(fā)病率逐漸上升,可引起外觀及視功能的損傷,臨床表現(xiàn)多樣,疾病后果嚴(yán)重,具體發(fā)病原因不明確,故近年來一直是困擾眼科醫(yī)生的難題。而吸煙被證明是甲狀腺相關(guān)性眼病(TAO)的重要危險(xiǎn)因素,另外,有研究發(fā)現(xiàn)吸煙與氧化應(yīng)激存在相關(guān)性,而我們已知氧化應(yīng)激在TAO的疾病過程中發(fā)揮著重要作用。香煙的成分十分復(fù)雜,其中公認(rèn)的毒性成分為尼古丁,目前國內(nèi)外在其他疾病方面針對(duì)吸煙的研究多采用香煙煙霧提取物(CSE)及尼古丁兩種物質(zhì)為刺激因素,眼眶成纖維細(xì)胞作為TAO的最終效應(yīng)細(xì)胞,是近年來TAO相關(guān)研究的經(jīng)典研究模型。故本研究采用原代培養(yǎng)的眼外肌來源眼眶成纖維細(xì)胞,研究香煙煙霧提取物及尼古丁作用于TAO患者及正常人眼眶成纖維細(xì)胞后,各種氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、MDA、8-OHdG的變化,探索香煙煙霧提取物及尼古丁在TAO這一疾病中是否通過氧化應(yīng)激發(fā)揮作用,其具體的劑量關(guān)系,并通過檢測(cè)香煙煙霧提取物及尼古丁對(duì)于眼眶成纖維細(xì)胞NF-kB通路的作用來進(jìn)一步探索其可能的作用機(jī)制。方法:1、取TAO患者及正常人的眼外肌組織,因標(biāo)本量少故采取組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng),獲得穩(wěn)定傳代的眼眶成纖維細(xì)胞,免疫組化的方法鑒定。2、用MTT法檢測(cè)香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細(xì)胞24小時(shí)及72小時(shí)后細(xì)胞的活性。3、ELISA法檢測(cè)香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細(xì)胞24小時(shí)及72小時(shí)后8-OHdG指標(biāo)的變化。4、分光光度計(jì)法檢測(cè)香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細(xì)胞24小時(shí)及72小時(shí)后MDA指標(biāo)的變化。5、酶標(biāo)儀法檢測(cè)香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細(xì)胞24小時(shí)后ROS指標(biāo)的變化6、RT-PCR法檢測(cè)香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細(xì)胞24小時(shí)后NF-kB相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果:1、本實(shí)驗(yàn)成功通過組織塊法原代培養(yǎng)眼外肌來源的成纖維細(xì)胞,能夠穩(wěn)定傳代,且經(jīng)過鑒定為眼眶成纖維細(xì)胞,能夠成功建立細(xì)胞系后作為甲狀腺相關(guān)性眼病的細(xì)胞模型,為后續(xù)試驗(yàn)提供可能。2、MTT檢測(cè)結(jié)果顯示24小時(shí)刺激,TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞在CSE刺激下細(xì)胞活力下降幅度更大,而在72小時(shí)刺激條件下,低濃度和高濃度的尼古丁呈現(xiàn)了相似的殺傷性。可見吸煙的損傷作用隨刺激時(shí)間的增強(qiáng)呈一定的累積作用。3、在24小時(shí)刺激條件下,尼古丁10ug/ml可顯著升高兩種細(xì)胞體內(nèi)8-OHdG的含量;在72小時(shí)刺激條件下,CSE單獨(dú)刺激和低濃度尼古丁即可引起8-OHdG產(chǎn)生的增加,可見高劑量的尼古丁可在短時(shí)間內(nèi)即可促進(jìn)8-OHdG含量的突然上升,而低劑量的尼古丁導(dǎo)致8-OHdG的緩慢積累。4、在同時(shí)給予CSE和尼古丁10ug/ml刺激之后,MDA含量相比CSE單獨(dú)刺激以及陰性對(duì)照組均有顯著的增加。在72小時(shí)刺激之后,觀察細(xì)胞體內(nèi)MDA含量變化,所有刺激條件對(duì)比陰性對(duì)照組MDA表達(dá)均有大幅度的增加。5、吸煙可通過增加ROS含量發(fā)揮作用。高濃度尼古丁的作用效果最明顯。6、在TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞中,CSE刺激之后NF-κB RNA水平顯著性上調(diào)�？梢娢鼰熗ㄟ^上調(diào)NF-κB基因的表達(dá)發(fā)揮作用。結(jié)論:吸煙可導(dǎo)致眼眶成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、8-OHdG及ROS增高,且尼古丁作為香煙中的主要毒性成分發(fā)揮作用,即使低濃度的尼古丁,也可隨時(shí)間累積而發(fā)揮較強(qiáng)的作用,說明吸煙可通過引起氧化應(yīng)激而參與TAO病理過程。其中可能的分子通路為NF-κB,吸煙可上調(diào)NF-κB基因的表達(dá)。
[Abstract]:The purpose of the study is that the thyroid-related eye disease is one of the most common diseases in the orbit, and the incidence of the thyroid-related eye disease is increasing gradually, which can cause the appearance and the visual function damage, the clinical manifestations are various, the disease is serious, the specific cause of the disease is not clear, so it has been a difficult problem for the ophthalmologist in recent years. Smoking has been shown to be an important risk factor for thyroid-associated ophthalmopathy (TAO) and, in addition, studies have found that there is a correlation between smoking and oxidative stress, and we know that oxidative stress plays an important role in the disease of TAO. The composition of the cigarette is very complex, and the recognized toxic component is nicotine. At present, the cigarette smoke extract (CSE) and the nicotine are used as the stimulating factor for the research of smoking in other diseases at home and abroad, and the orbital fibroblasts are the final effector cells of the TAO. It is a classic study model of TAO-related research in recent years. The primary cultured extraocular muscle derived orbital fibroblasts were used to study the changes of ROS, MDA,8-OHdG of cigarette smoke extract and nicotine in patients with TAO and normal human orbital fibroblasts. To explore the role of cigarette smoke extract and nicotine in the treatment of TAO by oxidative stress, its specific dose relationship, and to further explore its possible mechanism by detecting the effect of cigarette smoke extract and nicotine on the NF-kB pathway of the orbital fibroblasts. Methods:1. The extraocular muscle tissues of the patients with TAO and the normal persons were collected, and the primary culture was performed by the tissue-block method, and the orbital fibroblast and the immunohistochemical method of the stable passage were obtained. The activity of the cigarette smoke extract and the nicotine on the cell after 24 hours and 72 hours of the orbital fibroblasts was detected by the MTT method.3. The activity of the cigarette smoke extract and the nicotine on the orbital fibroblasts for 24 hours and 72 hours after 72 hours was detected by the ELISA method. The changes of the activity of the cigarette smoke extract and the nicotine on the content of MDA in 24 hours and 72 hours of the orbital fibroblasts were detected by the spectrophotometer. The expression of NF-kB related gene after 24 hours of orbital fibroblasts was detected by RT-PCR. Results:1. In this experiment, the fibroblasts of the extraocular muscle derived from the primary culture of the extraocular muscle were successfully cultured by the tissue-block method, and the cell line can be successfully established as the cell model of the thyroid-related ophthalmopathy after the cell line was successfully established. The results of the MTT assay showed that the activity of the orbital fibroblasts in the patients with TAO was greater than that of the CSE, while the low concentration and high concentration of nicotine exhibited similar anti-personnel effects at 72-hour stimulation. It can be seen that the damage effect of cigarette smoking has a certain accumulation function with the enhancement of the stimulation time.3. Under the condition of 24-hour stimulation, the content of 8-OHdG in the two cells can be significantly increased under the condition of 24-hour stimulation, and the increase of 8-OHdG can be caused by the single stimulation of CSE and low concentration of nicotine under the condition of 72-hour stimulation. A high dose of nicotine could promote a sudden rise in the content of 8-OHdG in a short period of time, while low-dose nicotine results in a slow accumulation of 8-OHdG.4. After both CSE and nicotine 10 ug/ ml stimulation, the MDA content was significantly increased as compared with the CSE alone and in the negative control group. After 72 hours of stimulation, the content of MDA in the cells was observed, and the expression of MDA in the negative control group was significantly increased in all the stimulation conditions.5. Smoking could play a role in increasing the ROS content. The effect of high concentration of nicotine was most obvious.6. In the orbital fibroblasts of patients with TAO, the level of NF-EMAB RNA was up-regulated after CSE stimulation. It can be seen that smoking plays a role by up-regulation of the expression of the NF-B-B gene. Conclusion: Smoking can lead to the increase of MDA,8-OHdG and ROS in the oxidative stress of the orbital fibroblasts, and the nicotine functions as the main toxic component in the cigarette. It is indicated that smoking can be involved in the TAO pathological process by causing oxidative stress. Among them, the possible molecular pathway is NF-B-B, and smoking can increase the expression of NF-B-B gene.
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R581;R771.3

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本文編號(hào)：2478977