【摘要】：第一部分糖尿病患者循環(huán)纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定目的：探討糖尿病患者外周血液循環(huán)纖維細(xì)胞(circulating fibrocytes, cFb)的分離、培養(yǎng)方法,為后繼開展燒傷患者cFb生物學(xué)活性研究探索條件。方法：采用密度梯度離心法分離燒傷患者外周血液?jiǎn)蝹�(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs),接種于含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中,連續(xù)培養(yǎng)28天。每次更換細(xì)胞培養(yǎng)液時(shí),除給予PBS漂洗之外,不作任何特殊處理。細(xì)胞分離、接種后當(dāng)天、第3、5-6、7-8、14、17、21、24、28天于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖及形態(tài)變化,并通過數(shù)碼相機(jī)采集圖片。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)分離培養(yǎng)14、28天的貼壁細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Co1-Iα、α-SMA、生長(zhǎng)因子TGF-β1、bFGF能力,從而對(duì)其進(jìn)行功能鑒定。結(jié)果：1)形態(tài)上,由糖尿病患者外周血分離得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞呈圓球形。分離、培養(yǎng)2～3天,絕大多數(shù)PBMCs仍呈散在圓球形、懸浮,但可見部分散在的細(xì)胞集落形成,其邊緣可有少量梭形貼壁細(xì)胞。至培養(yǎng)第4天,細(xì)胞集落現(xiàn)象更為明顯,梭形細(xì)胞數(shù)量增加。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),大約在培養(yǎng)第5-7天,細(xì)胞集落逐漸減少,到第10天,細(xì)胞集落基本完全消失,取而代之的是梭形細(xì)胞增殖,呈現(xiàn)典型的梭形成纖維細(xì)胞樣外觀,且排列規(guī)律。分離后第14天,梭形細(xì)胞密度增大,呈典型梭形,且規(guī)則排列。分離后第21天,細(xì)胞增殖旺盛,呈典型梭形,且規(guī)則排列。分離后第28天,可見細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增,呈典型梭形,且規(guī)則排列；2)體外培養(yǎng)28天的糖尿病患者cFb表達(dá)Co1-Iα和a-SMAmRNA的表達(dá)能力增強(qiáng),其中,Col-Iα mRNA的表達(dá)量相對(duì)于14天達(dá)到72716.74倍(P0.05),而a-SMAmRNA的表達(dá)量相對(duì)于14天仍呈上升趨勢(shì),為2.38倍,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；3)體外培養(yǎng)28天的糖尿病患者cFb與體外培養(yǎng)14天的糖尿病患者cFb相比,培養(yǎng)28天的cFb表達(dá)TGF-β1 mRNA的表達(dá)能力呈下降趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而bFGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量卻明顯提高,達(dá)前者的5.98倍(P0.05)。結(jié)論：通過密度梯度離心-貼壁培養(yǎng)的方法,可從糖尿病患者外周血液成功分離具有典型梭形外觀、高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志Co1-Iα和α-SMAmRNA的cFb。第二部分糖尿病對(duì)外周血液循環(huán)纖維細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子活性的影響目的：通過糖尿病患者與正常人外周血液循環(huán)纖維細(xì)胞(circulating fibrocytes, cFb)的對(duì)比研究,觀察兩者合成細(xì)胞外基質(zhì)Co1-Iα、α-SMA、趨化因子MIP-1α趨化因子受體CCR5、CXCR4.炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、生長(zhǎng)因子TGF-β1、bFGF mRNA的能力,旨在了解糖尿病對(duì)cFb以表達(dá)細(xì)胞因子的能力為代表的生物學(xué)活性的影響,為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用研究提供依據(jù)。方法：采用密度梯度離心法分離糖尿病患者和健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs),接種于含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中,連續(xù)培養(yǎng)28天。每次更換細(xì)胞培養(yǎng)液時(shí),除了給予PBS漂洗之外,不作任何處理。并于分離培養(yǎng)14天、28天對(duì)其分離成功率、cFb獲得率及增殖活性進(jìn)行觀察。以實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)培養(yǎng)14、28天的cFb表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)Co1-Iα、α-SMA、趨化因子MIP-1α、趨化因子受體CCR5、CXCR4、炎癥介質(zhì)TNF-α、 IL-6、生長(zhǎng)因子TGF-β1、bFGF mRNA的能力,并比較糖尿病患者與正常人cFb在上述時(shí)間點(diǎn)表達(dá)相關(guān)因子mRNA的能力。結(jié)果：1)在外周血液cFb分離培養(yǎng)過程中,45份正常人肝素抗凝血標(biāo)本和47份糖尿病患者肝素抗凝血標(biāo)本納入本研究進(jìn)行體外分離培養(yǎng)。結(jié)果顯示：正常組PBMCs成功分離43份(95%),獲得cFb的有25份(55%)：而糖尿病組PBMCs成功分離43份(91%),獲得cFb的有15份(32%)。對(duì)分離后獲得貼壁梭形細(xì)胞的樣品進(jìn)行體外增殖活性的觀察,結(jié)果顯示正常人cFb體外培養(yǎng)5至7天細(xì)胞融合率可達(dá)到約50%,而糖尿病患者cFb的增殖則顯著延遲,需要在體外培養(yǎng)10至14天細(xì)胞融合率才能達(dá)到約50%。2)體外培養(yǎng)14天的糖尿病患者cFb,細(xì)胞外基質(zhì)Co1-Iα、趨化因子MIP-1α、生長(zhǎng)因子bFGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于正常人cFb在相同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量,存在顯著差異(P0.05)；而細(xì)胞外基質(zhì)α-SMA、趨化因子受體CXCR4、炎癥介質(zhì)IL-6、生長(zhǎng)因子TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于正常人cFb在相同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；趨化因子受體CCR5、炎癥介質(zhì)TNF-amRNA相對(duì)表達(dá)量與正常人cFb在相同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量相似,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3)體外培養(yǎng)28天的糖尿病患者cFb,細(xì)胞外基質(zhì)Co1-Iα、生長(zhǎng)因子bFGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于正常人cFb在相同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量,有顯著差異(P0.05)；而趨化因子MIP-1α、趨化因子受體CXCR4、炎癥介質(zhì)IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于正常人cFb在相同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量,存在顯著差(P0.05)；細(xì)胞外基質(zhì)α-SMA.趨化因子受體CCR5、炎癥介質(zhì)TNF-α、生長(zhǎng)因子TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于正常人cFb在相同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量。但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1)糖尿病患者外周血液來源的cFb在成功率、獲得率、增殖活性等方面均低于正常對(duì)照組。2)體外培養(yǎng)14天及28天的糖尿病患者cFb表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)α-SMA、炎癥介質(zhì)、生長(zhǎng)因子TGF-β1 mRNA的能力均低于正常人cFb,提示糖尿病狀態(tài)可抑制外周血cFb表達(dá)與創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)因子的能力,影響其在糖尿病等慢性創(chuàng)面修復(fù)中的臨床應(yīng)用價(jià)值。3)體外培養(yǎng)14天及28天的糖尿病患者cFb表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)Co1-Iα生長(zhǎng)因子bFGFmRNA的能力強(qiáng)于正常人cFb,提示糖尿病狀態(tài)下cFb在細(xì)胞外基質(zhì)的合成、以及新生血管形成調(diào)節(jié)因子mRNA表達(dá)水平方面有所增強(qiáng),對(duì)糖尿病慢性創(chuàng)面愈合可能具有促進(jìn)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.1

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