【摘要】：第一部分糖尿病患者循環(huán)纖維細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定目的：探討糖尿病患者外周血液循環(huán)纖維細胞(circulating fibrocytes, cFb)的分離、培養(yǎng)方法,為后繼開展燒傷患者cFb生物學活性研究探索條件。方法：采用密度梯度離心法分離燒傷患者外周血液單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs),接種于含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中,連續(xù)培養(yǎng)28天。每次更換細胞培養(yǎng)液時,除給予PBS漂洗之外,不作任何特殊處理。細胞分離、接種后當天、第3、5-6、7-8、14、17、21、24、28天于倒置相差顯微鏡下觀察細胞增殖及形態(tài)變化,并通過數(shù)碼相機采集圖片。實時熒光定量PCR方法檢測分離培養(yǎng)14、28天的貼壁細胞表達細胞外基質(zhì)蛋白Co1-Iα、α-SMA、生長因子TGF-β1、bFGF能力,從而對其進行功能鑒定。結(jié)果：1)形態(tài)上,由糖尿病患者外周血分離得到的外周血單個核細胞呈圓球形。分離、培養(yǎng)2～3天,絕大多數(shù)PBMCs仍呈散在圓球形、懸浮,但可見部分散在的細胞集落形成,其邊緣可有少量梭形貼壁細胞。至培養(yǎng)第4天,細胞集落現(xiàn)象更為明顯,梭形細胞數(shù)量增加。隨著時間的延長,大約在培養(yǎng)第5-7天,細胞集落逐漸減少,到第10天,細胞集落基本完全消失,取而代之的是梭形細胞增殖,呈現(xiàn)典型的梭形成纖維細胞樣外觀,且排列規(guī)律。分離后第14天,梭形細胞密度增大,呈典型梭形,且規(guī)則排列。分離后第21天,細胞增殖旺盛,呈典型梭形,且規(guī)則排列。分離后第28天,可見細胞數(shù)量擴增,呈典型梭形,且規(guī)則排列；2)體外培養(yǎng)28天的糖尿病患者cFb表達Co1-Iα和a-SMAmRNA的表達能力增強,其中,Col-Iα mRNA的表達量相對于14天達到72716.74倍(P0.05),而a-SMAmRNA的表達量相對于14天仍呈上升趨勢,為2.38倍,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；3)體外培養(yǎng)28天的糖尿病患者cFb與體外培養(yǎng)14天的糖尿病患者cFb相比,培養(yǎng)28天的cFb表達TGF-β1 mRNA的表達能力呈下降趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),而bFGF mRNA的相對表達量卻明顯提高,達前者的5.98倍(P0.05)。結(jié)論：通過密度梯度離心-貼壁培養(yǎng)的方法,可從糖尿病患者外周血液成功分離具有典型梭形外觀、高表達間質(zhì)細胞標志Co1-Iα和α-SMAmRNA的cFb。第二部分糖尿病對外周血液循環(huán)纖維細胞表達細胞因子活性的影響目的：通過糖尿病患者與正常人外周血液循環(huán)纖維細胞(circulating fibrocytes, cFb)的對比研究,觀察兩者合成細胞外基質(zhì)Co1-Iα、α-SMA、趨化因子MIP-1α趨化因子受體CCR5、CXCR4.炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、生長因子TGF-β1、bFGF mRNA的能力,旨在了解糖尿病對cFb以表達細胞因子的能力為代表的生物學活性的影響,為進一步的臨床應用研究提供依據(jù)。方法：采用密度梯度離心法分離糖尿病患者和健康人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs),接種于含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中,連續(xù)培養(yǎng)28天。每次更換細胞培養(yǎng)液時,除了給予PBS漂洗之外,不作任何處理。并于分離培養(yǎng)14天、28天對其分離成功率、cFb獲得率及增殖活性進行觀察。以實時定量PCR檢測培養(yǎng)14、28天的cFb表達細胞外基質(zhì)Co1-Iα、α-SMA、趨化因子MIP-1α、趨化因子受體CCR5、CXCR4、炎癥介質(zhì)TNF-α、 IL-6、生長因子TGF-β1、bFGF mRNA的能力,并比較糖尿病患者與正常人cFb在上述時間點表達相關(guān)因子mRNA的能力。結(jié)果：1)在外周血液cFb分離培養(yǎng)過程中,45份正常人肝素抗凝血標本和47份糖尿病患者肝素抗凝血標本納入本研究進行體外分離培養(yǎng)。結(jié)果顯示：正常組PBMCs成功分離43份(95%),獲得cFb的有25份(55%)：而糖尿病組PBMCs成功分離43份(91%),獲得cFb的有15份(32%)。對分離后獲得貼壁梭形細胞的樣品進行體外增殖活性的觀察,結(jié)果顯示正常人cFb體外培養(yǎng)5至7天細胞融合率可達到約50%,而糖尿病患者cFb的增殖則顯著延遲,需要在體外培養(yǎng)10至14天細胞融合率才能達到約50%。2)體外培養(yǎng)14天的糖尿病患者cFb,細胞外基質(zhì)Co1-Iα、趨化因子MIP-1α、生長因子bFGFmRNA的相對表達量均高于正常人cFb在相同時間點的表達量,存在顯著差異(P0.05)；而細胞外基質(zhì)α-SMA、趨化因子受體CXCR4、炎癥介質(zhì)IL-6、生長因子TGF-β1 mRNA相對表達量均低于正常人cFb在相同時間點的表達量,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；趨化因子受體CCR5、炎癥介質(zhì)TNF-amRNA相對表達量與正常人cFb在相同時間點的表達量相似,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3)體外培養(yǎng)28天的糖尿病患者cFb,細胞外基質(zhì)Co1-Iα、生長因子bFGFmRNA的相對表達量均高于正常人cFb在相同時間點的表達量,有顯著差異(P0.05)；而趨化因子MIP-1α、趨化因子受體CXCR4、炎癥介質(zhì)IL-6mRNA相對表達量均低于正常人cFb在相同時間點的表達量,存在顯著差(P0.05)；細胞外基質(zhì)α-SMA.趨化因子受體CCR5、炎癥介質(zhì)TNF-α、生長因子TGF-β1 mRNA相對表達量均低于正常人cFb在相同時間點的表達量。但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論：1)糖尿病患者外周血液來源的cFb在成功率、獲得率、增殖活性等方面均低于正常對照組。2)體外培養(yǎng)14天及28天的糖尿病患者cFb表達細胞外基質(zhì)α-SMA、炎癥介質(zhì)、生長因子TGF-β1 mRNA的能力均低于正常人cFb,提示糖尿病狀態(tài)可抑制外周血cFb表達與創(chuàng)傷修復相關(guān)因子的能力,影響其在糖尿病等慢性創(chuàng)面修復中的臨床應用價值。3)體外培養(yǎng)14天及28天的糖尿病患者cFb表達細胞外基質(zhì)Co1-Iα生長因子bFGFmRNA的能力強于正常人cFb,提示糖尿病狀態(tài)下cFb在細胞外基質(zhì)的合成、以及新生血管形成調(diào)節(jié)因子mRNA表達水平方面有所增強,對糖尿病慢性創(chuàng)面愈合可能具有促進作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1

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本文編號：2476228