【摘要】：研究目的:強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種主要危害男性青壯年,以炎性腰背痛為主要癥狀,導(dǎo)致骶髂關(guān)節(jié)強(qiáng)直和脊柱強(qiáng)直的疾病,其病理特征是肌腱端炎、骨侵蝕、骨贅(新骨)形成。迄今為止,AS新骨形成的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。目前有證據(jù)提示IL-23在AS新骨形成中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),IL-23在肌腱端炎癥部位既能誘導(dǎo)骨形成,又能誘導(dǎo)骨破壞。IL-23可以通過RANKL等方式調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化,但對成骨細(xì)胞無直接作用。正常情況下,骨代謝(骨重建)處于骨吸收和骨形成的動態(tài)平衡中,破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞相互作用、相互調(diào)節(jié)。成骨細(xì)胞可通過表達(dá)M-CSF、RANKL、OPG等分子調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化。破骨細(xì)胞可通過表達(dá)Ephrin B2、SPHK1、BMP6、Wnt10b等分子,誘導(dǎo)成骨細(xì)胞前體向破骨部位趨化,并促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化成熟。破骨細(xì)胞也可通過增加semaphorin 4D、Htr A1的表達(dá)來抑制成骨細(xì)胞分化。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在探究IL-23是否誘導(dǎo)破骨細(xì)胞表達(dá)Ephrin B2、SPHK1、BMP2、BMP6、Wnt10b、Htr A1等分子,從而間接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化研究方法:首先,采用兩種方法誘導(dǎo)破骨細(xì)胞,第一種方法是用小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞。提取6-8周齡的C57/BL6小鼠的骨髓單核細(xì)胞,用含有M-CSF(50ng/ml)的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。隨后實(shí)驗(yàn)組用含有M-CSF(50ng/ml)和RANKL(30ng/ml)的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞5天,誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。對照組用不加RANKL的培養(yǎng)基培養(yǎng)。用TRAP染色來鑒定破骨細(xì)胞。第二種方法是用RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組是用含有RANKL(30ng/ml)的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞5天。對照組用不加RANKL的培養(yǎng)基培養(yǎng)。同樣采用TRAP染色鑒定破骨細(xì)胞。比較這兩種誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的效率,挑選一種誘導(dǎo)效率高的方法用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),并用real-time PCR方法檢測其TRAP、NFATc1的表達(dá)情況。其次,用IL-23刺激破骨細(xì)胞3h、6h、12h、24h,不加IL-23作為對照組。用real-time PCR的方法檢測Ephrin B2、SPHK1、BMP2、BMP6、Wnt10b、Htr A1等分子在m RNA水平的表達(dá)情況。最后,用IL-23刺激破骨細(xì)胞6h、12h、24h、48h,不加IL-23作為對照組。用western-blot的方法檢測Ephrin B2、SPHK1、BMP2、BMP6、Wnt10b、Htr A1等分子在蛋白水平的表達(dá)情況。研究結(jié)果:1.骨髓單核細(xì)胞經(jīng)M-CSF+RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)5日后,可見許多細(xì)胞直徑100um,TRAP染色為紫紅色,細(xì)胞核≥3個(gè)的多核巨細(xì)胞,即為成熟的破骨細(xì)胞。RAW264.7細(xì)胞經(jīng)RANKL誘導(dǎo)5日后,同樣可見一些細(xì)胞直徑100um,TRAP染色為紫紅色,細(xì)胞核≥3個(gè)的多核巨細(xì)胞。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),用小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)所得的破骨細(xì)胞明顯多于用RAW264.7誘導(dǎo)所得的破骨細(xì)胞。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞。用real-time PCR證實(shí)小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的TRAP、NFATc1的m RNA表達(dá)水平明顯高于對照組。表明此方法可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞,并可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞在IL-23刺激3-24h后,經(jīng)real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn),Ephrin B2、SPHK1、BMP2在m RNA水平的表達(dá)量均增加。Ephrin B2在IL-23刺激破骨細(xì)胞3小時(shí)的表達(dá)量是對照組的2.10倍。IL-23刺激3小時(shí),SPHK1的表達(dá)量是對照組的2.30倍,IL-23刺激6h,其表達(dá)量是對照組的2.46倍。BMP2在IL-23刺激3小時(shí)的表達(dá)量較對照組升高1.46倍。采用Western blot進(jìn)一步證實(shí)IL-23可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的Ephrin B2及SPHK1的蛋白表達(dá)明顯增多。3.經(jīng)real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn),IL-23刺激破骨細(xì)胞后,BMP6、Wnt10b、Semaphorin4D和Htr A1在m RNA水平的表達(dá)水平與對照組相比無明顯變化。研究結(jié)論:IL-23可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞(小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來)表達(dá)Ephrin B2、SPHK1、BMP2,但不影響破骨細(xì)胞表達(dá)BMP6、semaphorin 4D、Wnt10b、Htr A1。提示IL-23可能通過破骨細(xì)胞間接誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化成熟。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R593.23
，

本文編號：2468379