【摘要】：研究背景糖尿病是以慢性高血糖為主要特征的終身性、代謝性疾病,其發(fā)病可能與遺傳、環(huán)境及免疫失衡有關(guān)。當(dāng)前,全球糖尿病患病人數(shù)超過4.2億,發(fā)病率超過8.5%,且呈逐年上升的趨勢,已經(jīng)成為非常棘手的公共衛(wèi)生問題。中國的糖尿病發(fā)病率高于全球平均水平,目前糖尿病患者人數(shù)約占全球患者總量的四分之一,嚴(yán)重威脅著我國國民的健康和我國經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展。糖尿病本身并不可怕,其種類高達(dá)百種以上、可累及全身的并發(fā)癥才是造成患者身體損害的最直接原因。因此,各種并發(fā)癥的防治是糖尿病治療和管理的最重要和最終極目標(biāo)。然而,由于糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,使得目前的干預(yù)和治療措施,包括公認(rèn)最有效的強(qiáng)化血糖控制,均不能完全避免并發(fā)癥的發(fā)生,幾乎所有的患者最終會出現(xiàn)或輕或重、或多或少的并發(fā)癥。多個大型臨床試驗的研究結(jié)果顯示,強(qiáng)化血糖控制并不能降低大血管并發(fā)癥的發(fā)生率,其中一項研究結(jié)論甚至認(rèn)為,強(qiáng)化血糖控制有可能會增加糖尿病患者心血管事件的發(fā)生率;臨床實踐中也發(fā)現(xiàn),有些患者長期控制血糖在合理穩(wěn)定的水平,血脂、血壓等指標(biāo)也監(jiān)測正常,但最終仍發(fā)生一種或多種并發(fā)癥。因此,在糖尿病患者體內(nèi),除了已知的高血糖、高血脂等因素外,一定存在其他的異常,促進(jìn)著糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。因此,想要預(yù)防、治療、甚至逆轉(zhuǎn)糖尿病并發(fā)癥,單純依靠血糖管理還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,必須進(jìn)一步尋找糖尿病機(jī)體內(nèi)的其他異常并闡明其發(fā)生機(jī)理。糖尿病并發(fā)癥的本質(zhì)是患者體內(nèi)長期存在的高血糖等代謝紊亂及免疫異常引發(fā)微血管和大血管的損傷,并累及周圍神經(jīng)、眼底、心、腦、腎、足等,最終導(dǎo)致多種組織器官的結(jié)構(gòu)損傷和/或功能異常,使患者出現(xiàn)自覺癥狀或臨床表現(xiàn)。在糖尿病機(jī)體內(nèi)高血糖等代謝異常直接或間接導(dǎo)致靶組織損傷的同時,機(jī)體通過多種種子修復(fù)細(xì)胞進(jìn)行自我修復(fù)和再生;當(dāng)機(jī)體的自我修復(fù)機(jī)制失代償時,靶組織和靶器官就會出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)損傷及功能異常,即發(fā)生并發(fā)癥;若未得到合理有效的治療,損傷進(jìn)一步加深或累及更多的靶器官,使得并發(fā)癥加重或數(shù)量增多。因此,在嚴(yán)格控制血糖以減輕其對靶組織的直接或間接性損傷的同時,還應(yīng)同時給予干預(yù)措施以增強(qiáng)機(jī)體的修復(fù)代償機(jī)制,如此雙管齊下,可能是防治并發(fā)癥的有效途徑。糖尿病相關(guān)性組織損傷可累及全身,而具有強(qiáng)效再生修復(fù)功能的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)也具有全身性廣泛分布;另外,糖尿病患者體內(nèi)存在免疫異常,可能會攻擊自身組織結(jié)構(gòu),而MSC具有直接及間接的免疫調(diào)節(jié)功能,可能能對抗這種自我攻擊;MSC已經(jīng)被臨床用于多種糖尿病并發(fā)癥的治療,并顯示了很好的療效。毋庸置疑,MSC是糖尿病相關(guān)性損傷時,機(jī)體最重要的修復(fù)細(xì)胞之一。MSC的修復(fù)效能取決于其“質(zhì)”和“量”。在糖尿病機(jī)體中,MSCs“質(zhì)”的受損及機(jī)制已被很多研究證實,為大家所公認(rèn)。但是,關(guān)于其“量”的變化,我們卻知之甚少。雖然有動物實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠骨髓細(xì)胞中MSC的數(shù)量相對減少,但是目前無臨床的證據(jù),也缺乏相關(guān)的機(jī)制研究。另外,在靶組織和靶器官遭受糖尿病相關(guān)性攻擊和損害時,發(fā)揮修復(fù)和再生效應(yīng)的MSC主要直接招募自外周循環(huán);因此,外周循環(huán)中MSC的豐度可能是影響機(jī)體自我修復(fù)效能的重要因素。我們推測,糖尿病患者外周循環(huán)中MSC的數(shù)量相對缺乏。如果是這樣的話,其具體機(jī)制是什么呢?研究目的本研究旨在明確糖尿病微環(huán)境對MSC自我更新(增殖)和存活的影響,并初步探討其具體分子機(jī)制,以期解釋糖尿病患者體內(nèi)MSC數(shù)量相對缺乏的原因。另外,通過對分子機(jī)制的探討,并評價靶向干預(yù)手段對于MSC在糖尿病條件下存活的影響,為糖尿病及其并發(fā)癥的治療提供新的思路和理論依據(jù)。研究方法1.利用特異性抗體標(biāo)記及流式細(xì)胞術(shù)(FCM),檢測糖尿病患者及健康對照者外周循環(huán)中MSC-like(CD34~-/CD105~+)細(xì)胞的相對數(shù)量,并將檢測結(jié)果與患者的部分臨床資料進(jìn)行相關(guān)性分析;2.利用Lepr~(db/db)糖尿病小鼠及同窩出生的非糖尿病對照小鼠,對來自人群的檢測結(jié)果加以驗證;3.用糖尿病患者的血清(DS)和非糖尿病對照者的血清(NDS)分別模擬糖尿病微環(huán)境和非糖尿病微環(huán)境,用于體外相關(guān)實驗;4.分別培養(yǎng)人臍帶來源MSC(hUC-MSC)和小鼠骨髓來源MSC(mBM-MSC),利用細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測及多向誘導(dǎo)分化技術(shù)對擴(kuò)增純化的MSC進(jìn)行鑒定;5.利用以下多種技術(shù)手段分別評價MSC在不同血清、不同葡萄糖濃度、不同預(yù)處理等條件下的生長及存活情況:i.利用MTT法評價MSC在不同處理條件下,某一終點時刻的相對細(xì)胞活性ii.利用實時細(xì)胞分析(RTCA)技術(shù)對MSC在不通過處理條件下的生長及貼壁情況進(jìn)行實時動態(tài)檢測和評估iii.利用FCM檢測分析不同處理條件對MSC細(xì)胞周期的影響iv.分別利用以下方法分析不同處理條件對MSC凋亡的影響a)Hoechst 33258染色b)Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒聯(lián)合FCM檢測c)TUNEL凋亡試劑盒法v.利用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測不同處理條件下,MSC中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。6.血清補(bǔ)體水平的檢測i.CH50法檢測總補(bǔ)體活性ii.免疫比濁法檢測血清中C3和C4的含量iii.ELISA試劑盒檢測血清中sC5b-9和C5a的含量7.補(bǔ)體效應(yīng)的阻斷或增強(qiáng)方法i.56℃加熱處理30分鐘,消除血清的補(bǔ)體活性ii.用重組CD59蛋白預(yù)孵育MSC,以阻斷血清補(bǔ)體對MSC的溶破效應(yīng)iii.用anti-C5a中和抗體孵育血清以阻斷血清中C5a的效應(yīng);往NDS或熱滅活的DS(HI-DS)中添加重組C5a以增強(qiáng)或恢復(fù)C5a的效應(yīng)iv.用C5a受體(CD88)的拮抗劑PMX-53預(yù)孵育MSC,阻斷C5a對MSC表面CD88的活化8.MSC表面CD88的表達(dá)分析:i.反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測MSC中CD88 mRNA的表達(dá)ii.免疫印跡技術(shù)檢測MSC中CD88蛋白的表達(dá)iii.細(xì)胞免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步檢測CD88蛋白的表達(dá)及定位分析9.動物體內(nèi)實驗:i.用CD-DiI染料將mBM-MSC進(jìn)行熒光標(biāo)記后,經(jīng)尾靜脈注射移植入Lepr~(db/db)糖尿病小鼠或同窩出生的非糖尿病對照小鼠體內(nèi)。24小時后,FCM檢測小鼠外周血有核細(xì)胞中CD-DiI陽性標(biāo)記細(xì)胞的比例ii.將CD-DiI染料標(biāo)記后的mBM-MSC經(jīng)腹腔注射移植入Lepr~(db/db)小鼠或?qū)φ招∈篌w內(nèi),同時,Lepr~(db/db)小鼠經(jīng)腹腔注射CD88拮抗劑PMX-53或PBS。48或72小時后,收集腹腔灌洗液中的細(xì)胞,并進(jìn)行Annexin V-FITC染色,然后FCM檢測CD-DiI陽性標(biāo)記細(xì)胞中Annexin V-FITC陽性細(xì)胞的比例iii.培養(yǎng)CD88-/-小鼠骨髓來源的MSC(CD88-/-mBM-MSC),進(jìn)行CD-DiI標(biāo)記后,將腹腔注射移植入Lepr~(db/db)小鼠或?qū)φ招∈篌w內(nèi)。72小時后,按上述方法對植入細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行分析研究結(jié)果1.與非糖尿病個體相比,糖尿病個體外周循環(huán)中MSC-like細(xì)胞的數(shù)量明顯減少;而且,糖尿病患者并發(fā)癥的種類/個數(shù)與其循環(huán)MSC-like細(xì)胞的數(shù)量呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系;2.與NDS相比,DS顯著降低MSC的相對活性,抑制其細(xì)胞周期進(jìn)程并誘導(dǎo)其發(fā)生明顯的凋亡;3.高糖培養(yǎng)條件可促進(jìn)MSC的增殖而幾乎不影響其存活;DS對MSC的促凋亡效應(yīng)也與DS中所含的相對高濃度的葡萄糖無關(guān);4.與NDS相比,DS的總補(bǔ)體活性及多種補(bǔ)體成分的水平均明顯升高;人體外周循環(huán)中MSC-like細(xì)胞的數(shù)量與其血清補(bǔ)體的水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,且這一負(fù)相關(guān)關(guān)系在糖尿病患者中更顯著;5.熱滅活操作可大幅降低DS對MSC細(xì)胞活性、增殖及存活的抑制效應(yīng);HI-DS和HI-NDS對MSC的效應(yīng)/影響相當(dāng);6.阻斷補(bǔ)體的溶破效應(yīng)可改善MSC在DS條件下的存活,但作用有限;阻斷C5a/C5aR可大幅改善MSC在人血清(尤其是DS)條件下的存活;額外添加C5a會增強(qiáng)/恢復(fù)NDS或HI-DS對MSC的促凋亡效應(yīng);7.MSC細(xì)胞表面陽性表達(dá)CD88,且在DS條件下會發(fā)生表達(dá)上調(diào);8.CD88-/-mBM-MSC在NDS和DS條件下的凋亡情況相當(dāng);在DS條件下,與WT mBM-MSC相比,CD88-/-mBM-MSC中促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平相對較低,而抗凋亡的Bcl-2表達(dá)相對較高;9.阻斷或增強(qiáng)補(bǔ)體效應(yīng)的操作可顯著影響hUC-MSC被血清處理后凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平;10.靶向阻斷C5a/C5aR通路可以顯著降低mBM-MSC在Lepr~(db/db)小鼠體內(nèi)的凋亡發(fā)生率。研究結(jié)論基于本研究的研究結(jié)果,我們認(rèn)為,糖尿病患者外周循環(huán)中的MSC相對缺乏,使得受損的靶組織不能募集到足夠數(shù)量的MSC來發(fā)揮自我修復(fù)效應(yīng),最終導(dǎo)致了并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。糖尿病微環(huán)境不利于MSC的自我更新和存活,會誘導(dǎo)MSC發(fā)生凋亡性死亡,這可能是糖尿病患者循環(huán)MSC數(shù)量相對缺乏的重要原因之一。糖尿病微環(huán)境對MSC的促凋亡效應(yīng)與其所含的高糖因素?zé)o關(guān),而主要是通過異�；罨难a(bǔ)體系統(tǒng)來實現(xiàn),其中又以C5a引發(fā)的生物學(xué)效應(yīng)最為關(guān)鍵。靶向阻斷C5a/C5aR通路可以明顯改善MSC在體外及體內(nèi)糖尿病微環(huán)境條件下的存活,可能是一種提高循環(huán)MSC豐度的有效途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2

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本文編號：2452417