【摘要】：第一部分:大麻素受體介導棕色脂肪功能改善能量代謝目的:肥胖的發(fā)病機理復雜,已有大量通過增強棕色脂肪功能來治療肥胖的研究。而內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)與肥胖和胰島素抵抗的關(guān)系密切。然而目前內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)能否通過增強棕色脂肪功能進而減輕肥胖尚不清楚。本研究通過對大麻素受體CB1基因敲除小鼠模型觀察CB1受體對小鼠糖代謝、胰島素敏感性、攝食量和代謝率以及棕色脂肪產(chǎn)熱和糖脂代謝相關(guān)基因等的影響。方法:常規(guī)飼料喂養(yǎng)SPF級野生型WT小鼠和CB1基因敲除小鼠,每隔2-4周采用Echo MRI-100儀器進行磁共振(MRI)分析,通過全身掃描得到小鼠體脂含量(fat mass)和瘦體質(zhì)(lean mass)含量結(jié)果。采用開放式Oxymax間接測熱系統(tǒng)采集并分析小鼠攝食量相關(guān)指標、自主活動、能量消耗、呼吸商,隨后口服糖耐量試驗檢測各組小鼠血糖和葡萄糖刺激的胰島素釋放水平。處死小鼠后將肩胛區(qū)棕色組織切片,行HE染色,觀察棕色脂肪細胞形態(tài),采用real-time PCR和western blot檢測棕色脂肪能量代謝和糖脂代謝相關(guān)基因(UCP-1、PGC-1α、IR、IRS1、PPARy2)和蛋白表達水平。流式細胞儀檢測WT小鼠和CB1基因敲除小鼠腹腔內(nèi)巨噬細胞含量M1和M2。結(jié)果:從10周齡至第34周齡,CB1-/-小鼠與WT小鼠相比體重持續(xù)減輕;葡萄糖耐量試驗結(jié)果顯示CB1-/-小鼠在葡萄糖負荷后血糖上升的速度(Omin 127±8,15min481±21,30min 459±33,60min 409±37,120min191±24mg/dl)與 WT 小鼠(0min123±12,15min 427±26, 30min436±16,60min404±33, 120min 209±28mg/dl)相近(P0.05),而 CB1-/-小鼠(0min1.07±0.07,15min1.28±0.17,30min1.30±0.15,120min1.66±0.11ng/ml)胰島素分泌水平低于 WT 小鼠(Omin 1.46±0.15,15min2.09±0.34,30min 1.88±0.19,120min 2.68±0.46ng/ml)(P0.05);胰島素耐量試驗結(jié)果顯示 CB1-/-小鼠(Omin 166±4, 30min96±5,60min88±6, 90min111±10, 120min153±13mg/dl)血糖明顯低于 WT 小鼠(0min181±3,30min137±11,60min135±13, 90min142±16,120min173±21mg/d1)(P0.05);與 WT 小鼠相比,CB1-/-小鼠攝食總量和自主活動無明顯差異(P0.05);與WT小鼠相比,CB1-/-小鼠能量消耗高于WT小鼠(P0.05); HE染色結(jié)果顯示,WT小鼠脂肪細胞的平均大小為853.2± 109.5μm2,而CB1-/-小鼠肩胛棕色脂肪細胞的平均大小為693.4±148.5μm2,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);棕色脂肪組織基因分析結(jié)果顯示,CB1-/-小鼠產(chǎn)熱和糖脂代謝關(guān)鍵的因子(UCP-1、PGC-1α、IR、IRS1、PPARy2)均顯著高于WT小鼠(P0.05);流式細胞結(jié)果顯示CB1小鼠腹腔內(nèi)巨噬細胞與WT小鼠相比,M1減少,M2增多,M1/M2減少(P0.05)。結(jié)論:正常飼料喂養(yǎng)的CB1基因敲除組小鼠體重、體脂含量較正常小鼠明顯減輕,胰島素敏感性增加。雖然CB1基因敲除小鼠攝食的模式有所改變,但是攝食總量、自主活動較正常小鼠無明顯減低。進一步通過代謝分析發(fā)現(xiàn),CB1基因敲除小鼠無論是白天還是夜間,能量消耗增加;同時與產(chǎn)熱糖脂代謝相關(guān)的基因和蛋白在棕色脂肪表達明顯增加。因此,本實驗證實CB1受體敲除小鼠可能是通過增強棕色脂肪功能而體重減輕的。第二部分GLP-1受體激動劑增強高脂喂養(yǎng)的小鼠棕色脂肪功能目的:近來研究發(fā)現(xiàn)GLP-1受體激動劑不僅具有降血糖作用,而且還能減重,但是目前其減重機制尚未闡明。本研究通過高脂飲食喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠模型,觀察GLP-1受體激動劑對小鼠體重、糖代謝、胰島素敏感性、攝食量和代謝率,以及棕色脂肪產(chǎn)熱和脂代謝相關(guān)基因等的影響。方法:6周齡C57BL/6J小鼠分為常規(guī)飼料喂養(yǎng)組(CON),高脂飼料喂養(yǎng)組(HFD)和高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合GLP-1受體激動劑exendin-4皮下干預(yù)組(HFD+EX),每隔2-4周采用Echo MRI-100儀器進行磁共振(MRI)分析,通過全身掃描計算各種小鼠體脂含量和瘦體質(zhì)含量結(jié)果。16周后口服葡萄糖糖耐量試驗檢測各組小鼠血糖和胰島素耐量試驗,隨后采用開放式Oxymax間接測熱系統(tǒng)采集并分析HFD和HFD+EX組小鼠攝食量相關(guān)指標、自主活動、能量消耗、呼吸商。各組小鼠棕色組織切片行HE染色觀察肩胛區(qū)棕色脂肪細胞形態(tài)并比較棕色細胞大小,real-time PCR和western blot檢測肩胛區(qū)棕色脂肪能量代謝(UCP-1和PGC-1α)和脂代謝(GLUT4、PPARy2、perilipin)相關(guān)mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果:隨著喂養(yǎng)時間的延長,HFD組體重和體脂含量高于CON組,而HFD+EX組則明顯低于HFD組(P0.05);葡萄糖耐量試驗結(jié)果顯示,HFD組與CON組小鼠相比糖耐量減低,而 HFD+EX 組明顯改善(0-30-60-90-120min: CON 組:91±4-359±50-345±35-260±40-169±33mg/dlvs.HFD 組:122±17-430±55-490±38-453±76-228±47mg/dl vs.HFD+EX 組 116±16-373±49-391±55-326±57-182±34 mg/dl)(P0.05)。胰島素耐量試驗結(jié)果顯示,HFD組血糖較CON組明顯升高,而HFD+EX組較HFD組血糖下降(CON:119±11-68±17-84±8-91±8-101±11mg/dlvs.HFD:134±8-113±17-102±6-115±5-120±4mg/dlvs.HFD+EX: 123±11-93±12-89±27-96±19-106±13 mg/dl) (P0.05);間接代謝測定顯示,HFD和HFD+EX組攝食相關(guān)指標攝食量、活動量無明顯差異(P0.05)。但是產(chǎn)熱量HFD+EX組高于HFD組,呼吸商低于HFD+EX組(P0.05); HE染色結(jié)果顯示,與正常飼養(yǎng)喂養(yǎng)組相比,高脂喂養(yǎng)組肩胛棕色脂肪細胞面積明顯增大(3011.8±566.3 vs 711.3±247.1μm2),而exendin-4干預(yù)組脂肪細胞面積較高脂組明顯減少(956.8±350.1μm2)(P0.05);棕色脂肪組織基因和蛋白分析結(jié)果顯示,與正常飼料喂養(yǎng)組相比,高脂喂養(yǎng)組產(chǎn)熱和脂肪代謝關(guān)鍵的基因表達下降;與高脂喂養(yǎng)組相比,exendin-4干預(yù)組產(chǎn)熱和脂肪代謝基因表達均顯著升高(P0.05)。結(jié)論:GLP-1受體激動劑exendin-4能減輕高脂喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠體重、體脂含量,且能明顯改善高脂飲食引起的糖耐量異常和胰島素敏感性下降,改善脂代謝。exendin-4能增加高脂喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠的產(chǎn)熱,增加棕色脂肪與產(chǎn)熱和脂代謝相關(guān)的基因和蛋白表達。這些結(jié)果表明,GLP-1受體激動劑可能通過增強棕色脂肪功能,增加產(chǎn)熱而發(fā)揮減重作用。第三部分GLP-1受體激動劑exendin-4通過拮抗CB1受體增強棕色脂肪細胞功能目的:本部分實驗利用體外培養(yǎng)的棕色脂肪細胞,旨在研究GLP-1受體激動劑exendin-4是否通過拮抗CB1受體從而影響棕色脂肪細胞功能,并觀察其下游信號通路。方法:體外培養(yǎng)小鼠棕色脂肪細胞,采用real-time PCR檢測不同濃度GLP-1受體激動劑exendin-4和GLP-1受體拮抗劑exendin(9-39)干預(yù)棕色脂肪細胞CB1的表達;以及檢測GLP-1受體激動劑exendin-4和CB1受體激動劑WIN55干預(yù)后棕色脂肪細胞產(chǎn)熱相關(guān)基因UCP-1、PGC-1α和成脂基因PPARγ2表達。Seahorse細胞能量代謝實時檢測GLP-1受體激動劑exendin-4和CB1受體激動劑WIN55干預(yù)后棕色脂肪細胞能量變化。Westernblot檢測GLP-1受體激動劑exendin-4和CB1受體激動劑WIN55干預(yù)后棕色脂肪細胞信號通道蛋白AMPK表達水平。結(jié)果:GLP-1受體激動劑exendin-4通過濃度依賴方式減少棕色脂肪細胞CB1的表達,而GLP-1受體拮抗劑exendin(9-39)則增加棕色脂肪細胞CB1的表達(P0.05)。CB1受體激動劑WIN55干預(yù)組與對照組相比,棕色脂肪細胞產(chǎn)熱相關(guān)基因UCP-1、PGC-1α和成脂基因PPARγ2表達明顯下降,GLP-1受體激動劑exendin-4干預(yù)組較對照組UCP-1、PGC-1α和PPARy2的表達明顯升高(P0.05),而exendin-4聯(lián)合WIN55共同干預(yù)組UCP-1、PGC-1α和PPARγ2的表達卻較exendin-4干預(yù)組明顯下降(P0.05)。Seahorse細胞能量代謝結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,exendin-4干預(yù)組棕色脂肪細胞最大呼吸強度明顯增加(P0.05), WIN55干預(yù)組后棕色脂肪細胞細胞最大呼吸強度較對照組降低(P0.05)。而exendin-4聯(lián)合WIN55共同干預(yù)后棕色脂肪細胞最大呼吸強度較單獨exendin-4干預(yù)組下降(P0.05)。蛋白分析結(jié)果顯示,與對照組相比,exendin-4干預(yù)組棕色脂肪細胞蛋白pAMPK表達增加;WIN55干預(yù)組棕色脂肪細胞蛋白pAMPK表達較對照組降低。而exendin-4聯(lián)合WIN55共同干預(yù)后棕色脂肪細胞pAMPK表達較單獨exendin-4干預(yù)組降低(P0.05)。結(jié)論:Exendin-4可能通過拮抗棕色脂肪細胞CB1受體進而影響其下游相關(guān)產(chǎn)熱以及脂代謝基因的表達,并且可能通過激活A(yù)MPK信號途徑而發(fā)揮作用。本研究進一步明確了 GLP-1受體激動劑促進棕色脂肪功能增強的具體機制,并為治療肥胖開辟了新思路。
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【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R589.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉娟;王龍;胡淼;丁國憲;;小鼠棕色脂肪原代培養(yǎng)模型的建立[J];南京醫(yī)科大學學報(自然科學版);2011年12期

2 武陽豐,馬冠生,胡永華,李艷平,李賢,崔朝輝,陳春明,孔靈芝;中國居民的超重和肥胖流行現(xiàn)狀[J];中華預(yù)防醫(yī)學雜志;2005年05期

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本文編號：2440049