【摘要】：實驗目的大量研究證實血漿中含量最高的脂肪因子脂聯(lián)素(Adiponectin,AD)參與類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)的發(fā)病過程。我們前期工作證實RA患者滑膜組織中AD及Adipo R1表達明顯高于正常人群;而關節(jié)局部高表達的脂聯(lián)素可加重膠原誘導關節(jié)炎小鼠(Collagen-induced arthritis,CIA)的骨破壞,其機制尚不十分清楚。RA滑膜成纖維細胞(Rheumatoid arthritis synovial fibroblasts,RASFs)與OA滑膜成纖維細胞或皮膚的成纖維細胞有著迥然不同的特性,表現(xiàn)為異常增生能力、介導炎癥稽留、遷移及侵襲等類腫瘤特性。其中,RASFs獨特的遷移和侵襲特性在RA骨侵蝕中起著至關重要的作用。因此本研究主要探討AD是否通過影響RASFs遷移性及侵襲性等類腫瘤生物學特性,介導RA炎癥及骨侵蝕病理過程。1.AD對RASFs遷移及侵襲特性的影響體內(nèi)實驗:構(gòu)建膠原誘導關節(jié)炎(CIA)小鼠模型,小鼠關節(jié)局部注射脂聯(lián)素,觀察AD對CIA鼠關節(jié)炎癥及骨侵襲的影響。體外實驗:細胞劃痕實驗及Transwell corning實驗觀察不同濃度AD(0、0.1、1和10μg/ml)與RASFs培養(yǎng)24h后對RASFs遷移的影響。用覆蓋明膠的Transwell corning實驗觀察不同濃度AD(0、0.1、1和10μg/ml)與RASFs培養(yǎng)24h后對RASFs的侵襲作用。將AD受體(Adiponectin receptors,Adipo Rs)沉默后,觀察AD對RASFs的遷移及侵襲特性的影響是否依賴Adipo Rs。2.AD對RASFs基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2,9表達的影響體內(nèi)實驗:觀察CIA小鼠關節(jié)局部滑膜組織中AD m RNA表達與MMP-2,MMP-9m RNA表達的相關性;觀察CIA小鼠關節(jié)局部注射AD后對關節(jié)組織中MMP-2,MMP-9表達的影響。體外實驗:Real-time PCR方法及Western blot方法檢測AD是對RASFs中MMP-2,MMP-9表達的影響。觀察沉默Adipo Rs后,AD對RASFs中MMP-2,MMP-9表達的影響。3.AD對RASFs內(nèi)PI3K/AKT信號通路的影響PI3K/AKT信號通路與細胞遷移、粘附、血管生成及細胞外基質(zhì)降解密切相關。用10μg/ml AD在不同時間點(0min、5min、10min、15min、30min、60min)刺激RASFs,收取細胞,提蛋白,采用western blot方法檢測RASFs中PI3K、AKT磷酸化情況的變化。實驗結(jié)果1.AD通過Adipo R1促進RASFs遷移性及侵襲性體內(nèi)實驗:與CIA組鼠相比,CIA小鼠關節(jié)局部注射AD后,滑膜炎癥、滑膜增生及骨侵蝕明顯增加。體外實驗:AD(10μg/ml)組較空白組顯著促進RASFs遷移通過Transwell小室微孔的數(shù)目(234.3±69.1 Vs 127.3±42.5),且具有統(tǒng)計學差異(P0.05);Adipo R1沉默后,RASFs遷移(137.3±14.3 Vs 94±0.9)及侵襲(151.9±28.6 Vs108.3±26.3)通過Transwell小室微孔的數(shù)目明顯減少,具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。沉默Adipo R2,RASFs遷移數(shù)與未沉默組無明顯差異。2.AD通過AdipoR1促進RASFs中MMP-2,MMP-9表達體內(nèi)實驗:CIA小鼠關節(jié)滑膜組織中MMP-2、MMP-9 m RNA表達較正常小鼠組明顯增加;且MMP-2和MMP-9 m RNA表達與AD m RNA表達成正相關(相關系數(shù)分別為r=0.6723,0.4569,顯著性p0.05)。與未注射組相比,CIA組小鼠關節(jié)局部注射AD后,關節(jié)組織中MMP-2、MMP-9的表達明顯增高。體外實驗:AD(10μg/ml)組較空白組顯著促進RASFs表達MMP-2(12.11±4.28 Vs 2.19±1.32,P0.05)及MMP-9(26.12±13.74 Vs 2.80±2.30,P0.05).沉默Adipo Rs后,Adipo R1干擾組較空白載體干擾組(Negative Control,NC)組MMP-2(1.78±0.48 Vs 4.27±2.45),MMP-9(2.66±1.83 Vs 11.25±7.88)表達顯著下降且具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。Adipo R2干擾組較空白載體干擾組MMP-2(4.14±2.17 Vs 4.27±4.25),MMP-9(5.26±2.80 Vs 11.25±7.88)表達下調(diào),但無明顯統(tǒng)計學差異。2.AD對RASFs內(nèi)PI3K/AKT信號通路AD刺激RASFs30min后,胞內(nèi)PI3K在開始進行磷酸化持續(xù)至60min。其中,AKT308位點在15min開始磷酸化,30min達到磷酸化高峰;473位點在30min開始進行磷酸化持續(xù)至60min。實驗結(jié)論1.AD可促進RASF遷移及侵襲特性,可能是其加重RA骨侵蝕,參與RA病理過程的重要機制之一。2.AD可促進RASF遷移及侵襲作用相關因子MMP-2,MMP-9表達3.AD通過Adipo R1影響RASF遷移性、侵襲特性及MMP-2,MMP-9表達。4.AD促進RASFs PI3K/AKT信號通路的磷酸化,可能是影響RASFs的遷移及侵襲特性的主要胞內(nèi)信號通路。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R593.22

【參考文獻】

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1 談文峰;王芳;張繆佳;劉曉華;郭敦明;朱曉敏;張海地;;運用基因芯片初步研究類風濕關節(jié)炎患者外周血單個核細胞基因表達譜特征[J];中華風濕病學雜志;2006年12期

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本文編號：2427277