【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇罅垦芯孔C實(shí)血漿中含量最高的脂肪因子脂聯(lián)素(Adiponectin,AD)參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)的發(fā)病過(guò)程。我們前期工作證實(shí)RA患者滑膜組織中AD及Adipo R1表達(dá)明顯高于正常人群;而關(guān)節(jié)局部高表達(dá)的脂聯(lián)素可加重膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠(Collagen-induced arthritis,CIA)的骨破壞,其機(jī)制尚不十分清楚。RA滑膜成纖維細(xì)胞(Rheumatoid arthritis synovial fibroblasts,RASFs)與OA滑膜成纖維細(xì)胞或皮膚的成纖維細(xì)胞有著迥然不同的特性,表現(xiàn)為異常增生能力、介導(dǎo)炎癥稽留、遷移及侵襲等類腫瘤特性。其中,RASFs獨(dú)特的遷移和侵襲特性在RA骨侵蝕中起著至關(guān)重要的作用。因此本研究主要探討AD是否通過(guò)影響RASFs遷移性及侵襲性等類腫瘤生物學(xué)特性,介導(dǎo)RA炎癥及骨侵蝕病理過(guò)程。1.AD對(duì)RASFs遷移及侵襲特性的影響體內(nèi)實(shí)驗(yàn):構(gòu)建膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型,小鼠關(guān)節(jié)局部注射脂聯(lián)素,觀察AD對(duì)CIA鼠關(guān)節(jié)炎癥及骨侵襲的影響。體外實(shí)驗(yàn):細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell corning實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度AD(0、0.1、1和10μg/ml)與RASFs培養(yǎng)24h后對(duì)RASFs遷移的影響。用覆蓋明膠的Transwell corning實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度AD(0、0.1、1和10μg/ml)與RASFs培養(yǎng)24h后對(duì)RASFs的侵襲作用。將AD受體(Adiponectin receptors,Adipo Rs)沉默后,觀察AD對(duì)RASFs的遷移及侵襲特性的影響是否依賴Adipo Rs。2.AD對(duì)RASFs基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2,9表達(dá)的影響體內(nèi)實(shí)驗(yàn):觀察CIA小鼠關(guān)節(jié)局部滑膜組織中AD m RNA表達(dá)與MMP-2,MMP-9m RNA表達(dá)的相關(guān)性;觀察CIA小鼠關(guān)節(jié)局部注射AD后對(duì)關(guān)節(jié)組織中MMP-2,MMP-9表達(dá)的影響。體外實(shí)驗(yàn):Real-time PCR方法及Western blot方法檢測(cè)AD是對(duì)RASFs中MMP-2,MMP-9表達(dá)的影響。觀察沉默Adipo Rs后,AD對(duì)RASFs中MMP-2,MMP-9表達(dá)的影響。3.AD對(duì)RASFs內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響PI3K/AKT信號(hào)通路與細(xì)胞遷移、粘附、血管生成及細(xì)胞外基質(zhì)降解密切相關(guān)。用10μg/ml AD在不同時(shí)間點(diǎn)(0min、5min、10min、15min、30min、60min)刺激RASFs,收取細(xì)胞,提蛋白,采用western blot方法檢測(cè)RASFs中PI3K、AKT磷酸化情況的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.AD通過(guò)Adipo R1促進(jìn)RASFs遷移性及侵襲性體內(nèi)實(shí)驗(yàn):與CIA組鼠相比,CIA小鼠關(guān)節(jié)局部注射AD后,滑膜炎癥、滑膜增生及骨侵蝕明顯增加。體外實(shí)驗(yàn):AD(10μg/ml)組較空白組顯著促進(jìn)RASFs遷移通過(guò)Transwell小室微孔的數(shù)目(234.3±69.1 Vs 127.3±42.5),且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);Adipo R1沉默后,RASFs遷移(137.3±14.3 Vs 94±0.9)及侵襲(151.9±28.6 Vs108.3±26.3)通過(guò)Transwell小室微孔的數(shù)目明顯減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。沉默Adipo R2,RASFs遷移數(shù)與未沉默組無(wú)明顯差異。2.AD通過(guò)AdipoR1促進(jìn)RASFs中MMP-2,MMP-9表達(dá)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中MMP-2、MMP-9 m RNA表達(dá)較正常小鼠組明顯增加;且MMP-2和MMP-9 m RNA表達(dá)與AD m RNA表達(dá)成正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為r=0.6723,0.4569,顯著性p0.05)。與未注射組相比,CIA組小鼠關(guān)節(jié)局部注射AD后,關(guān)節(jié)組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)明顯增高。體外實(shí)驗(yàn):AD(10μg/ml)組較空白組顯著促進(jìn)RASFs表達(dá)MMP-2(12.11±4.28 Vs 2.19±1.32,P0.05)及MMP-9(26.12±13.74 Vs 2.80±2.30,P0.05).沉默Adipo Rs后,Adipo R1干擾組較空白載體干擾組(Negative Control,NC)組MMP-2(1.78±0.48 Vs 4.27±2.45),MMP-9(2.66±1.83 Vs 11.25±7.88)表達(dá)顯著下降且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。Adipo R2干擾組較空白載體干擾組MMP-2(4.14±2.17 Vs 4.27±4.25),MMP-9(5.26±2.80 Vs 11.25±7.88)表達(dá)下調(diào),但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.AD對(duì)RASFs內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路AD刺激RASFs30min后,胞內(nèi)PI3K在開始進(jìn)行磷酸化持續(xù)至60min。其中,AKT308位點(diǎn)在15min開始磷酸化,30min達(dá)到磷酸化高峰;473位點(diǎn)在30min開始進(jìn)行磷酸化持續(xù)至60min。實(shí)驗(yàn)結(jié)論1.AD可促進(jìn)RASF遷移及侵襲特性,可能是其加重RA骨侵蝕,參與RA病理過(guò)程的重要機(jī)制之一。2.AD可促進(jìn)RASF遷移及侵襲作用相關(guān)因子MMP-2,MMP-9表達(dá)3.AD通過(guò)Adipo R1影響RASF遷移性、侵襲特性及MMP-2,MMP-9表達(dá)。4.AD促進(jìn)RASFs PI3K/AKT信號(hào)通路的磷酸化,可能是影響RASFs的遷移及侵襲特性的主要胞內(nèi)信號(hào)通路。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R593.22

【參考文獻(xiàn)】

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1 談文峰;王芳;張繆佳;劉曉華;郭敦明;朱曉敏;張海地;;運(yùn)用基因芯片初步研究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞基因表達(dá)譜特征[J];中華風(fēng)濕病學(xué)雜志;2006年12期

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本文編號(hào)：2427277