【摘要】：目的microRNA是一類進化上高度保守,長度約為22nt的單鏈小分子非編碼RNA,參與轉錄后水平的基因調控。脂肪細胞和成骨細胞的分化存在著相互制約的關系。有研究表明microRNA在間充質干細胞向脂肪細胞及成骨細胞分化過程中起到重要的調控作用。本研究以miR-20a-5p為對象探討其對于脂肪細胞分化的作用及作用機制,并探討在體內抑制miR-20a-5p的表達后對于小鼠肥胖的影響。方法1.分離并培養(yǎng)小鼠骨髓間充質干細胞,實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-20a-5p在誘導成脂分化過程中的差異表達,并檢測了miR-20a-5p在骨髓基質細胞系ST2誘導成脂分化過程中的表達變化;分析ob/ob肥胖小鼠及正常C57BL/6J小鼠脂肪細胞中miR-20a-5p的表達差異。在骨髓基質細胞系ST2及間充質干細胞系C3H10T1/2中提高或降低miR-20a-5p的水平,利用q RT-PCR、western blotting和Oil Red O Staining等技術觀察miR-20a-5p對ST2和C3H10T1/2細胞成脂分化的影響。2.利用靶基因預測軟件及熒光素酶報告基因技術鑒定miR-20a-5p的靶基因,并通過基因功能缺失性和獲得性研究探索靶基因調節(jié)細胞分化的作用機制。3.采用高脂飲食喂養(yǎng)小鼠8周誘導肥胖模型,同時尾靜脈注射構建好的miR-20a-5p sponge慢病毒,在飼養(yǎng)過程中記錄小鼠體重。飼養(yǎng)結束后,稱取各組小鼠體重和脂肪重量,取血清檢測血糖、血脂等相關生化指標,采用蘇木精-伊紅(HE)染色方法對各組小鼠的脂肪組織進行石蠟切片染色,q RT-PCR檢測各組小鼠脂肪組織脂肪分化及合成關鍵因子的表達量。結果1.miR-20a-5p在小鼠骨髓間充質干細胞及ST2細胞誘導成脂分化的過程中表達上升,并且在ob/ob肥胖小鼠脂肪組織中的表達水平顯著高于正常C57BL/6小鼠。在ST2細胞、C3H10T1/2細胞和小鼠骨髓間充質干細胞中增強miR-20a-5p表達后,細胞成脂分化加強,脂肪細胞分化關鍵轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCATT增強結合蛋白α(CCATT enhancer binding protein alpha,C/EBPα)、CCATT增強結合蛋白β(CCATT enhancer binding protein beta,C/EBPβ)和表征因子脂肪酸結合蛋白(adipocyte fatty acid-binding protein,a P2)等表達顯著升高。相反,抑制內源性miR-20a-5p表達則可抑制ST2等細胞分化為成熟脂肪細胞。2.通過生物信息學在線分析工具預測了miR-20a-5p的候選靶基因為TGF-βII型受體(transforming growth factor-βreceptor II,Tgfbr2)、賴氨酸特異性脫甲基酶酶6B(lysine-specific demethylase 6B,Kdm6b)、Wwtr1(WW domain containing transcription regulator 1)、骨硬化相關跨膜蛋白(osteopetrosis associated transmembrane protein 1,Ostm1)和核轉錄因子-C(nuclear factor I-C,Nfic),成功構建了包含miR-20a-5p應答序列的Tgfbr2、Kdm6b、Wwtr1、Ostm1和Nfic3’UTR的重組報告載體,熒光素酶報告基因測定證實了miR-20a-5p能夠結合Tgfbr2、Kdm6b和Nfic 3’UTR而阻斷其表達。靶基因功能研究發(fā)現(xiàn),過表達Kdm6b能夠抑制ST2細胞成脂分化,抑制Kdm6b則會顯著促進ST2細胞成脂分化。NFIC能夠通過轉錄調控Lrp5表達而激活Wnt/β-catenin信號通路,從而抑制成脂分化而促進成骨分化。此外,研究證實NFIC能夠與miR-20a-5p promoter結合,抑制miR-20a-5p的表達,提示miR-20a-5p與NFIC之間存在調節(jié)環(huán)路,協(xié)同調控間充質干細胞的成脂分化。3.高脂飲食誘導8周后成功構建肥胖小鼠模型,具體表現(xiàn)為高脂飲食組體重增加、Lee’s指數(shù)變大、脂肪重量增加、脂肪細胞體積變大、糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗。而尾靜脈注射miR-20a-5p sponge慢病毒后能夠有效抑制高脂飲食鼠肥胖的發(fā)生,同時降低血糖、甘油三酯、游離脂肪酸等糖脂代謝生化指標,提高機體對于胰島素的敏感性。q RT-PCR檢測尾靜脈注射miR-20a-5p sponge慢病毒后能有效抑制脂肪分化及合成關鍵因子的表達。結論1.miR-20a-5p與肥胖密切相關,表現(xiàn)為在肥胖小鼠脂肪組織及分化成熟的脂肪細胞中高表達。miR-20a-5p可以促進骨髓間充質干細胞、ST2和C3H10T1/2的成脂分化。2.Tgfbr2、Kdm6b和Nfic為miR-20a-5p的靶基因,且均為脂肪細胞分化的負性調控因子,miR-20a-5p能夠靶向抑制Tgfbr2、Kdm6b和Nfic的表達。3.Kdm6b能夠抑制ST2細胞成脂分化。NFIC能夠通過轉錄調控調控Lrp5表達而激活Wnt/β-catenin信號通路,從而抑制成脂分化而促進成骨分化。4.NFIC能夠與miR-20a-5p啟動子結合,抑制miR-20a-5p的轉錄,miR-20a-5p與NFIC形成了負調控環(huán)路,共同調節(jié)間充質干細胞的定向分化。5.在小鼠體內,抑制miR-20a-5p的表達能夠抑制肥胖發(fā)生。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R589.2

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本文編號：2424792