【摘要】：目的microRNA是一類進化上高度保守,長度約為22nt的單鏈小分子非編碼RNA,參與轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控。脂肪細胞和成骨細胞的分化存在著相互制約的關(guān)系。有研究表明microRNA在間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞及成骨細胞分化過程中起到重要的調(diào)控作用。本研究以miR-20a-5p為對象探討其對于脂肪細胞分化的作用及作用機制,并探討在體內(nèi)抑制miR-20a-5p的表達后對于小鼠肥胖的影響。方法1.分離并培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-20a-5p在誘導(dǎo)成脂分化過程中的差異表達,并檢測了miR-20a-5p在骨髓基質(zhì)細胞系ST2誘導(dǎo)成脂分化過程中的表達變化;分析ob/ob肥胖小鼠及正常C57BL/6J小鼠脂肪細胞中miR-20a-5p的表達差異。在骨髓基質(zhì)細胞系ST2及間充質(zhì)干細胞系C3H10T1/2中提高或降低miR-20a-5p的水平,利用q RT-PCR、western blotting和Oil Red O Staining等技術(shù)觀察miR-20a-5p對ST2和C3H10T1/2細胞成脂分化的影響。2.利用靶基因預(yù)測軟件及熒光素酶報告基因技術(shù)鑒定miR-20a-5p的靶基因,并通過基因功能缺失性和獲得性研究探索靶基因調(diào)節(jié)細胞分化的作用機制。3.采用高脂飲食喂養(yǎng)小鼠8周誘導(dǎo)肥胖模型,同時尾靜脈注射構(gòu)建好的miR-20a-5p sponge慢病毒,在飼養(yǎng)過程中記錄小鼠體重。飼養(yǎng)結(jié)束后,稱取各組小鼠體重和脂肪重量,取血清檢測血糖、血脂等相關(guān)生化指標,采用蘇木精-伊紅(HE)染色方法對各組小鼠的脂肪組織進行石蠟切片染色,q RT-PCR檢測各組小鼠脂肪組織脂肪分化及合成關(guān)鍵因子的表達量。結(jié)果1.miR-20a-5p在小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞及ST2細胞誘導(dǎo)成脂分化的過程中表達上升,并且在ob/ob肥胖小鼠脂肪組織中的表達水平顯著高于正常C57BL/6小鼠。在ST2細胞、C3H10T1/2細胞和小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中增強miR-20a-5p表達后,細胞成脂分化加強,脂肪細胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCATT增強結(jié)合蛋白α(CCATT enhancer binding protein alpha,C/EBPα)、CCATT增強結(jié)合蛋白β(CCATT enhancer binding protein beta,C/EBPβ)和表征因子脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty acid-binding protein,a P2)等表達顯著升高。相反,抑制內(nèi)源性miR-20a-5p表達則可抑制ST2等細胞分化為成熟脂肪細胞。2.通過生物信息學(xué)在線分析工具預(yù)測了miR-20a-5p的候選靶基因為TGF-βII型受體(transforming growth factor-βreceptor II,Tgfbr2)、賴氨酸特異性脫甲基酶酶6B(lysine-specific demethylase 6B,Kdm6b)、Wwtr1(WW domain containing transcription regulator 1)、骨硬化相關(guān)跨膜蛋白(osteopetrosis associated transmembrane protein 1,Ostm1)和核轉(zhuǎn)錄因子-C(nuclear factor I-C,Nfic),成功構(gòu)建了包含miR-20a-5p應(yīng)答序列的Tgfbr2、Kdm6b、Wwtr1、Ostm1和Nfic3’UTR的重組報告載體,熒光素酶報告基因測定證實了miR-20a-5p能夠結(jié)合Tgfbr2、Kdm6b和Nfic 3’UTR而阻斷其表達。靶基因功能研究發(fā)現(xiàn),過表達Kdm6b能夠抑制ST2細胞成脂分化,抑制Kdm6b則會顯著促進ST2細胞成脂分化。NFIC能夠通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控Lrp5表達而激活Wnt/β-catenin信號通路,從而抑制成脂分化而促進成骨分化。此外,研究證實NFIC能夠與miR-20a-5p promoter結(jié)合,抑制miR-20a-5p的表達,提示miR-20a-5p與NFIC之間存在調(diào)節(jié)環(huán)路,協(xié)同調(diào)控間充質(zhì)干細胞的成脂分化。3.高脂飲食誘導(dǎo)8周后成功構(gòu)建肥胖小鼠模型,具體表現(xiàn)為高脂飲食組體重增加、Lee’s指數(shù)變大、脂肪重量增加、脂肪細胞體積變大、糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗。而尾靜脈注射miR-20a-5p sponge慢病毒后能夠有效抑制高脂飲食鼠肥胖的發(fā)生,同時降低血糖、甘油三酯、游離脂肪酸等糖脂代謝生化指標,提高機體對于胰島素的敏感性。q RT-PCR檢測尾靜脈注射miR-20a-5p sponge慢病毒后能有效抑制脂肪分化及合成關(guān)鍵因子的表達。結(jié)論1.miR-20a-5p與肥胖密切相關(guān),表現(xiàn)為在肥胖小鼠脂肪組織及分化成熟的脂肪細胞中高表達。miR-20a-5p可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞、ST2和C3H10T1/2的成脂分化。2.Tgfbr2、Kdm6b和Nfic為miR-20a-5p的靶基因,且均為脂肪細胞分化的負性調(diào)控因子,miR-20a-5p能夠靶向抑制Tgfbr2、Kdm6b和Nfic的表達。3.Kdm6b能夠抑制ST2細胞成脂分化。NFIC能夠通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)控Lrp5表達而激活Wnt/β-catenin信號通路,從而抑制成脂分化而促進成骨分化。4.NFIC能夠與miR-20a-5p啟動子結(jié)合,抑制miR-20a-5p的轉(zhuǎn)錄,miR-20a-5p與NFIC形成了負調(diào)控環(huán)路,共同調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細胞的定向分化。5.在小鼠體內(nèi),抑制miR-20a-5p的表達能夠抑制肥胖發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R589.2

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 盧慧玲;調(diào)節(jié)脂肪細胞分化的分子機制[J];醫(yī)學(xué)綜述;2003年05期

2 何靜,王平芳;脂肪細胞分化的分子機制研究進展[J];國外醫(yī)學(xué)(生理、病理科學(xué)與臨床分冊);2004年05期

3 祝驥,馬文麗,毛向明,李凌,吳清華,鄭文嶺;綠色熒光蛋白基因在脂肪細胞分化研究中的應(yīng)用[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2005年09期

4 龍璐;王平芳;;過氧化物酶體增殖物激活受體及其調(diào)控脂肪細胞分化的研究進展[J];中國全科醫(yī)學(xué);2006年01期

5 王寧;閆曉紅;;脂肪細胞分化輔助調(diào)節(jié)因子的研究進展[J];生理科學(xué)進展;2009年04期

6 李名森;蔡東宏;;白色脂肪細胞分化分子機制研究進展[J];中山大學(xué)研究生學(xué)刊(自然科學(xué).醫(yī)學(xué)版);2013年01期

7 趙琳;脂肪細胞分化過程的細胞表型和分子事件[J];中國康復(fù)理論與實踐;2002年11期

8 張崇本;脂肪細胞的分化及調(diào)控[J];生理科學(xué)進展;2004年01期

9 趙萸;脂肪細胞分化的調(diào)控及與2型糖尿病的關(guān)系[J];國外醫(yī)學(xué)(內(nèi)分泌學(xué)分冊);2004年01期

10 倪毓輝,郭錫熔,陳榮華;脂肪細胞分化的表型特征、分子標志和調(diào)控[J];國外醫(yī)學(xué)(兒科學(xué)分冊);2004年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 束剛;江青艷;傅偉龍;;脂肪細胞分化調(diào)控的研究進展[A];動物生理生化學(xué)分會第八次學(xué)術(shù)會議暨全國反芻動物營養(yǎng)生理生化第三次學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2004年

2 張娟;唐紅菊;王曉;周麗斌;;小檗堿抑制脂肪細胞分化的機制研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十二次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2013年

3 劉峰;;脂肪細胞分化、功能與調(diào)控[A];細胞—生命的基礎(chǔ)——中國細胞生物學(xué)學(xué)會2013年全國學(xué)術(shù)大會·武漢論文摘要集[C];2013年

4 潘杰;;脂肪細胞分化成熟中脂質(zhì)調(diào)控因子的作用[A];第11屆全國脂質(zhì)與脂蛋白學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2012年

5 肖宏濤;劉毅;陳克明;;凍存復(fù)蘇人臍帶間充質(zhì)干細胞體外擴增和向脂肪細胞分化的研究[A];第七屆全國創(chuàng)傷學(xué)術(shù)會議暨2009海峽兩岸創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)論壇論文匯編[C];2009年

6 肖宏濤;劉毅;陳克明;;凍存復(fù)蘇人臍帶間充質(zhì)干細胞體外擴增和向脂肪細胞分化的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會燒傷外科學(xué)分會2009年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

7 張志威;榮恩光;史明欣;陳月嬋;閆曉紅;王寧;李輝;;雞KLF2基因的表達分析和功能研究[A];中國的遺傳學(xué)研究——遺傳學(xué)進步推動中國西部經(jīng)濟與社會發(fā)展——2011年中國遺傳學(xué)會大會論文摘要匯編[C];2011年

8 許金飛;洪尚宇;廖侃;;Akt是3T3L1前脂肪細胞分化和克隆擴增所必需的信號分子[A];中國細胞生物學(xué)學(xué)會第八屆會員代表大會暨學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2003年

9 武春艷;王宇祥;張志威;李輝;;過表達SREBP1基因?qū)﹄u脂肪細胞分化標志基因啟動子活性的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家禽學(xué)分會第九次代表會議暨第十六次全國家禽學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2013年

10 夏黎;季晨博;郭錫熔;;miRNA與脂肪細胞分化、肥胖[A];中華醫(yī)學(xué)會第十七次全國兒科學(xué)術(shù)大會論文匯編（下冊）[C];2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 周杰;miR-20a-5p調(diào)節(jié)脂肪細胞分化的作用機制及對小鼠肥胖的影響[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

2 黃家鑫;C/EBPβ在脂肪細胞分化過程中對自噬的調(diào)控及SC01在肥胖相關(guān)代謝性疾病中的機制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

3 王姍;RNA結(jié)合蛋白QKI在脂肪細胞分化中的作用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

4 高鵬;生長激素與其信號分子STAT5B對脂肪細胞分化的影響[D];山東大學(xué);2015年

5 段中潮;Tudor-SN蛋白調(diào)控脂肪分化的機制及其對代謝的影響[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

6 何群;TAZ在脂肪細胞分化過程中的作用及調(diào)節(jié)[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

7 韓吉龍;脂尾型綿羊尾部脂肪富集的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

8 黃琦;NR4A1和Nat1在2型糖尿病發(fā)病中的調(diào)控作用[D];武漢大學(xué);2014年

9 周一然;蛋白激酶C-βΙ和-δ在脂肪細胞分化中的作用[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2006年

10 杜寶文;新基因篩選及其在脂肪細胞中的功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 唐飛;具有干預(yù)脂肪細胞分化活性天然產(chǎn)物Nigrasin Ⅰ的全合成及構(gòu)效關(guān)系研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 彭地莎;FAM3A基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析及其在脂肪生成中的作用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 鄒磊;PCAF通過活化FOXO1促進前脂肪細胞分化[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

4 徐慧;三種不同結(jié)構(gòu)的葉瓜參鞘脂對脂肪細胞分化和脂質(zhì)代謝的調(diào)控作用研究[D];中國海洋大學(xué);2015年

5 王彤彤;Gpr54在脂質(zhì)代謝中的生物學(xué)功能及其機理研究[D];華東師范大學(xué);2015年

6 楊yN琦;維生素D受體在SD大鼠原代脂肪細胞分化過程中的表達規(guī)律及脂質(zhì)沉積研究[D];陜西理工學(xué)院;2016年

7 遲玉楊;LiCl對3T3-L1前脂肪細胞分化以及Villin2和β-catenin基因表達的影響[D];吉林大學(xué);2016年

8 秦佑;樹豆酮酸A抑制3T3-L1脂肪細胞分化及調(diào)控其脂質(zhì)代謝的作用研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2016年

9 占猛斯;miR-425對3T3-L1細胞分化的抑制作用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

10 王昌蘭;miR-196b-5p對脂肪細胞分化的調(diào)控[D];天津醫(yī)科大學(xué);2016年

，

本文編號：2424792