【摘要】：目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)是以高血糖、高血脂為特征的代謝性疾病,糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是繼發(fā)于DM患者的常見并發(fā)癥,其危害極大,已成為DM患者死亡的首要病因。早期表現(xiàn)為舒張功能降低,心肌順應能力下降、舒張期充盈受限,晚期為收縮功能降低,易導致心衰。DCM的發(fā)病機制尚未完全闡明。脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)或c-Jun氨基末端激酶(JNK)可調(diào)節(jié)免疫應答,已有實驗證實,Syk或JNK抑制劑均可引起巨噬細胞中NLRP3的活性下降。而且在高糖誘導的H9c2心肌細胞中p-JNK、NLRP3的表達升高,在高糖誘導的HK-2人腎小管上皮細胞中p-Syk的表達升高,表明p-Syk、p-JNK和NLRP3與DM的致病機制相關(guān)。但在DCM炎癥損傷中Syk是否發(fā)揮作用以及與JNK和NLRP3的作用關(guān)系迄今還沒有報道。因此,文章通過體內(nèi)實驗檢測了1型糖尿病SD大鼠和正常對照SD大鼠心肌組織中Syk、JNK及NLRP3的表達,通過體外實驗研究高糖誘導的乳鼠原代心肌細胞和大鼠H9c2心肌細胞中Syk、JNK及NLRP3炎癥小體之間的作用機制,為治療DCM提供了新的依據(jù)。方法1.構(gòu)建糖尿病大鼠動物模型:將SD大鼠隨機分為Ctrl組和DCM組。DCM組大鼠一次性腹腔注射65 mg/kg STZ溶液(1%STZ),而Ctrl組大鼠以相同的方式注射同等量的檸檬酸溶液(PH 4.2)。3天后測量并記錄實驗大鼠的血糖及體重,若血糖濃度16.7 mmol/L為糖尿病模型;超聲心動圖和血流動力學監(jiān)測Ctrl組和DCM組大鼠的心臟功能改變;兩組大鼠心肌組織進行HE(Hematoxylin-eosin)和馬松(Masson)染色,光鏡下觀察心肌組織構(gòu)造的病理改變。2.Western Blot方法檢測造模后第16周的DCM組大鼠和Ctrl組大鼠心肌中p-Syk、p-JNK及NLRP3的蛋白水平。3.H9c2細胞株的分組情況:Ctrl組(正常糖濃度5.5 mmol/L處理)、HG處理組(高糖濃度25 mmol/L處理)、抑制劑對照組(Syk抑制劑BAY61-3606濃度1μmol/L處理2 h,或JNK抑制劑SP濃度20μmol/L處理1 h,然后正常糖濃度5.5 mmol/L處理)以及抑制劑實驗組(Syk抑制劑BAY61-3606濃度1μmol/L處理2 h,或JNK抑制劑SP濃度20μmol/L處理1 h,然后高糖濃度25 mmol/L處理),RT-PCR實驗檢測加入BAY61-3606或SP抑制劑后NLRP3、Caspase-1和IL-1β的m RNA的表達水平;Western Blot實驗檢測BAY61-3606或SP抑制劑處理后NLRP3的蛋白水平變化。4.新生乳鼠心肌細胞分組情況:Ctrl組(正常糖濃度5.5 mmol/L處理)、HG處理組(高糖濃度25 mmol/L處理)、抑制劑對照組(Syk抑制劑BAY61-3606濃度1μmol/L處理2 h,或JNK抑制劑SP濃度20μmol/L處理1 h,然后正常糖濃度5.5 mmol/L處理)以及抑制劑實驗組(Syk抑制劑BAY61-3606濃度1μmol/L處理2 h,或JNK抑制劑SP濃度20μmol/L處理1 h,然后高糖濃度25 mmol/L處理),RT-PCR實驗檢測加入BAY61-3606或SP抑制劑后NLRP3、Caspase-1和IL-1β的m RNA的表達水平;Western Blot實驗檢測BAY61-3606或SP抑制劑處理后NLRP3的蛋白水平變化。5.小干擾RNA對H9c2細胞中Syk基因進行干擾,然后用RT-PCR方法和Real-Time PCR實驗方法測定干擾序列的干擾效率;Western Blot實驗檢測Syk-si RNA轉(zhuǎn)染后NLRP3的蛋白水平變化;Real-Time PCR實驗檢測Syk-si RNA處理后NLRP3、Caspase-1和IL-1β的m RNA表達水平。6.Western Blot實驗測定Syk-si RNA或BAY61-3606處理后大鼠H9c2細胞株中p-JNK的蛋白水平變化。7.Western Blot實驗測定Syk抑制劑BAY61-3606處理后乳鼠心肌細胞中p-JNK的蛋白水平變化。結(jié)果1.一次性腹腔注射大劑量STZ后,DCM組可見“三多一少”癥候,且精力不振,毛發(fā)干燥,嚴重者可見白內(nèi)障現(xiàn)象,Ctrl組大鼠精力良好,運動敏捷。DCM組隨機血糖濃度明顯高于Ctrl組(P0.01),且體重明顯下降(P0.01);STZ注射第12周發(fā)現(xiàn),兩組大鼠左心室功能出現(xiàn)明顯不同,DCM組大鼠E/A比值、FS和EF均顯著低于Ctrl組大鼠(P0.05);HE結(jié)果表明,DCM組大鼠與Ctrl組相比部分心肌細胞體積明顯增大,心肌肌纖維走向雜亂,炎性細胞大量浸潤。Masson結(jié)果表明,DCM組大鼠與Ctrl組相比心肌間質(zhì)及血管周圍膠原成分大量累積,纖維化嚴重。以上結(jié)果均表明SD大鼠1型糖尿病心肌病動物模型構(gòu)建成功。2.大鼠心臟組織Western Blot方法結(jié)果顯示,DCM組大鼠心肌組織中p-Syk、p-JNK、NLRP3蛋白表達水平明顯升高。3.RT-PCR結(jié)果表明,在大鼠H9c2細胞株中,BAY61-3606或SP抑制劑顯著減輕高糖引起的NLRP3、Caspase-1和IL-1β的m RNA表達量(P0.05);Western Blot實驗顯示,BAY61-3606或SP預處理顯著阻礙了NLRP3的蛋白水平,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.RT-PCR結(jié)果表明,在乳鼠原代心肌細胞中,BAY61-3606或SP抑制劑顯著減輕高糖引起的NLRP3、Caspase-1和IL-1β的m RNA表達量(P0.05);Western Blot結(jié)果表明,BAY61-3606或SP預處理顯著阻滯了NLRP3的蛋白表達,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.RT-PCR和Real-Time PCR結(jié)果表明,Syk-si RNA可顯著沉默Syk的表達(P0.05);Western Blot結(jié)果顯示,Syk-si RNA干擾顯著阻礙了NLRP3的蛋白量,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);Real-Time PCR定量結(jié)果表明,Syk-si RNA干擾抑制了NLRP3、Caspase-1和IL-1β的m RNA表達,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。6.Western Blot結(jié)果表明,與NC-si RNA組對比,Syk-si RNA干擾明顯抑制了H9c2細胞中p-JNK的蛋白表達(P0.05)。7.Western Blot結(jié)果表明,BAY61-3606預處理明顯抑制了H9c2細胞株中p-JNK的蛋白水平,在乳鼠原代心肌細胞中亦得到相似的結(jié)果,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論綜上所述,本實驗成功地構(gòu)建了SD大鼠1型DCM動物模型,而且p-Syk、p-JNK及NLRP3的蛋白水平在糖尿病大鼠心臟組織中顯著升高。p-Syk、p-JNK、NLRP3炎癥小體和IL-1β與DCM的發(fā)病機制密切相關(guān)。Syk介導的JNK和NLRP3的活化這一途徑參與了DCM致病過程。
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【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R542.2

【參考文獻】

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本文編號：2421311