【摘要】：研究背景及目的：胰島p細胞的損傷和凋亡是糖尿病發(fā)病的機理之一,引起機體胰島素分泌相對或絕對不足從而出現(xiàn)高血糖狀態(tài)。與其他組織細胞相比,胰島β細胞的抗氧化能力水平低。有研究報道高糖、高脂、炎性因子、鏈脲佐菌素、過氧化氫等均可引起胰島p細胞發(fā)生凋亡或壞死。隨著對糖尿病發(fā)病機制的不斷研究,有研究發(fā)現(xiàn),在胰島p細胞的微生存環(huán)境中,高糖、高脂、炎性因子等在引起胰島p細胞凋亡或壞死的同時伴有腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin Angiotensin System,RAS)的激活。而目前已有大量的基礎(chǔ)研究證實在人、大鼠、小鼠、犬類等多種動物的胰腺上均存在合成血管緊張素Ⅱ(AngiotensinII,Ang II)的獨立體系,并在胰腺局部發(fā)揮重要的調(diào)控作用。胰腺局部的RAS具有自身的特點,不依賴于腎臟,可以自身合成、釋放,并通過胞內(nèi)分泌、旁分泌、自分泌的方式來發(fā)揮對細胞的生長、分化、增殖、凋亡,組織炎癥及纖維化等的生理及病理生理作用。近年有循證醫(yī)學研究證實,使用血管緊張素受體拮抗劑(Angiotensin receptor blocker,ARB)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI),可以有效降低具有高危因素(肥胖、心血管疾病、吸煙等)患者新發(fā)2型糖尿病的風險,其具體機制目前尚不清楚。本課題組的前期研究也證實血管緊張素受體1(AT1受體)拮抗劑厄貝沙坦可以拮抗高糖環(huán)境中胰島β細胞凋亡,其可能機制與抑制AT1R、AngⅡ mRNA表達,阻斷RAS通路,以及抗氧化和下調(diào)凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-3 mRNA的表達有關(guān)。本實驗選擇NOD小鼠胰島細胞瘤NIT-1胰島細胞,它具有胰島p細胞的功能,體外培養(yǎng)以存活,并通過不同途徑來源的氧化應(yīng)激因素鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)及過氧化氫(H202)誘導胰島NIT-1細胞損傷,建立胰島細胞內(nèi)和細胞外氧化損傷模型,進一步進行厄貝沙坦對凋亡胰島NIT-1細胞觀察研究。本研究內(nèi)容分為兩部分：第一部分是建立胞內(nèi)胞外胰島NIT-1細胞損傷模型,第二部分是厄貝沙坦對鏈脲佐菌素及過氧化氫誘導胰島NIT-1細胞凋亡的影響,為臨床開展糖尿病的病因治療、指導糖尿病的防治提供實驗及理論依據(jù)。材料和方法：本實驗設(shè)計分為兩部分,第一部分是建立胞內(nèi)胞外胰島NIT-1細胞損傷模型：選取對數(shù)生長期的NOD小鼠胰島p細胞株NIT-1細胞,分別加入STZ和H2O2干預,分組如下圖所示(圖1)：STZ組：加入濃度為1、2與5mmol/LSTZ溶液干預胰島NIT-1細胞30min,收集細胞；H202組：分別加入300及500 μmol/LH202干預胰島NIT-1細胞30min,按濃度高低分為D組、E組；另設(shè)空白對照組(F組),該組細胞不加入任何干預因素,每組3例,上述細胞數(shù)量為106個。檢測指標為Hochest33342染色觀察細胞形態(tài),Annenxin-V/PI染色進行流式細胞技術(shù)檢測各組細胞凋亡率,RT-PCR方法檢測各組細胞凋亡因子Caspase-3 mRNA的表達。第二部分是根據(jù)第一部分建立所得的NIT-1胰島p細胞凋亡模型基礎(chǔ)上,在上部分內(nèi)容的基礎(chǔ)上分別選取終濃度為2mmol/LSTZ.300 μmol/L的H2O2干預細胞30min,棄干預液,分別加入不同濃度(0.1、0.01、0.001mmol/L及Ommo/L即無厄貝沙坦的陽性組)的厄貝沙坦培養(yǎng)液,按厄貝沙坦?jié)舛确纸M,如下圖所示(圖1、圖2)：同時設(shè)空白對照組(Normal Control Group, NC組)。根據(jù)不同實驗要求,第一部分實驗內(nèi)容：收集各組細胞,采用Hochest33342熒光染色法觀察各組細胞的凋亡形態(tài),流式凋亡檢測技術(shù)檢測各組細胞的凋亡率,在所測得流式細胞凋亡率的基礎(chǔ)上,選擇誘導胰島NIT-1細胞凋亡率適中的STZ及H2O2濃度組即(B組和D組)繼續(xù)進行RT-PCR技術(shù)檢測各組細胞凋亡因子Caspase-3 mRNA的表達。第二部分,以2mmol/LSTZ及300 μmol/LH2O2誘導胰島NIT-1細胞凋亡,Annexin-V/PI雙染流式細胞儀技術(shù)凋亡各組細胞的凋亡率,CellROX流式細胞儀技術(shù)檢測各組細胞活性氧族(Reactive Oxygen Species, ROS)的含量,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)檢測各組細胞AT1、Caspase-3、NADPH mRNA的表達。結(jié)果：第一部分胞內(nèi)胞外胰島NIT-1細胞氧化應(yīng)激損傷模型各組細胞實驗結(jié)果：① Hochest33342熒光染色下各組細胞在熒光顯微鏡下細胞形態(tài)的描述：F組細胞的彌漫均勻淡藍色熒光,細胞形態(tài)較規(guī)則,多數(shù)細胞胞膜完整,A組細胞著色與細胞形態(tài)大致與F組相近,B組可見部分細胞細胞核成亮藍色熒光,胞核濃縮,細胞形態(tài)大小不一,C組和E組細胞熒光亮度不均一、細胞形態(tài)不規(guī)則、胞膜不完整,細胞碎片較多。D組細胞部分細胞成強藍色熒光,并見細胞形態(tài)大小不一,有細胞碎片。② Annexin-V/PI雙染流式細胞儀技術(shù)檢測各組細胞凋亡率結(jié)果：A、B、C、D、E5組細胞凋亡率與F組比較,A、 B、C、D、E 5組細胞凋亡率顯著升高P0.05。③ RT-PCR技術(shù)檢測B組D組及F組細胞Caspase-3的相對表達量結(jié)果：與F組比較,B組和D組的胰島NIT-1細胞Caspase-3增高(P0.05)。第二部分厄貝沙坦對STZ及H202誘導胰島NIT-1細胞凋亡的影響實驗結(jié)果：①Annexin-V/PI雙染流式細胞儀技術(shù)檢測各組細胞凋亡率：G1、G2、G3組的細胞凋亡率均少于G4組(P0.05), H1、H2、H3組的細胞凋亡率少于H4組,且細胞凋亡率隨著厄貝沙坦?jié)舛鹊脑黾蛹芭囵B(yǎng)時間的延長而逐漸減少。② ellROX流式細胞儀技術(shù)檢測各組細胞ROS相對含量的表達：G1、G2、G3組的細胞ROS相對含量均低于G4組(P0.05), H1、H2、H3組的ROS相對含量低于H4組(P0.05),且細胞ROS的相對含量也隨著厄貝沙坦?jié)舛鹊脑黾蛹芭囵B(yǎng)時間的延長而逐漸減少。③ RT-PCR技術(shù)檢測各組細胞基因的相對表達量結(jié)果：G1、G2、G3組的細胞ROS相對含量均少于G4組(P0.05), H1、H2、H3組的ROS相對含量低于H4組(P0.05),厄貝沙坦組的Caspase-3、NADPH mRNA的表達量下降(P0.05),AT1 mRNA的表達量也呈下降趨勢(P0.05)。結(jié)論：1、一定濃度的STZ及H202作用于胰島NIT-1細胞30min可以造成胰島NIT-1細胞損傷。2、厄貝沙坦通過降低胰島NIT-1細胞的凋亡率、抑制ROS的產(chǎn)生、下調(diào)Caspase-3、NADPH、AT1 mRNA的表達,對胰島NIT-1細胞產(chǎn)生一定的保護作用,但厄貝沙坦的保護作用是否與抑制AT1受體有關(guān)有待進一步的研究。
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【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1

【參考文獻】

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本文編號：2402063