【摘要】：骨質(zhì)疏松癥是嚴重危害老年人群健康的慢性骨代謝病,其發(fā)病機制復雜,防治難度大。維生素D是體內(nèi)調(diào)節(jié)骨代謝的一種重要激素,可通過間接作用和對成骨細胞的直接作用影響骨形成,因此維生素D在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制及防治中起重要作用。維生素D在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物1a,25-二羥維生素D[1,25(OH)2D]一方面可通過促進腸道鈣吸收間接作用于骨形成。此外,成骨細胞表達維生素D受體(vitamin D receptor,VDR),也是1,25(OH)2D作用的重要靶器官。體外成骨細胞培養(yǎng)表明生理量的1,25(OH)2D可刺激成骨細胞分化、促進骨形成。但維生素D對成骨細胞直接調(diào)控的詳細分子機制還有待深入研究。hnRNPC1/C2的經(jīng)典角色是作為RNA結(jié)合蛋白在RNA加工中發(fā)揮多重作用,包括影響前體m RNA的剪接和選擇性剪接。而本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),hnRNPC1/C2還可與1,25(OH)2D/VDR復合物競爭,并結(jié)合位于1,25(OH)2D靶基因上游啟動子區(qū)域的維生素D反應(yīng)元件(vitamin D response elements,VDREs),在轉(zhuǎn)錄水平參與1,25(OH)2D介導的基因表達調(diào)控。鑒于上述hn RNPC1/C2對轉(zhuǎn)錄和RNA剪接的雙重作用,我們推測hn RNPC1/C2可能作為偶聯(lián)因子在轉(zhuǎn)錄和RNA剪接兩個水平協(xié)調(diào)維生素D介導的成骨細胞基因表達調(diào)控。本研究的第一部分以人原代成骨細胞(primary human osteoblasts,h OBs)和MG63成骨細胞系為模型,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組高通量測序手段,在轉(zhuǎn)錄和剪接水平探討了hn RNPC1/C2對1,25(OH)2D介導的成骨細胞基因表達調(diào)控的影響。近年來的多項研究顯示心血管系統(tǒng)疾病和骨質(zhì)疏松癥存在相關(guān)性,它們共同發(fā)生在老年期,經(jīng)常在同一老年個體可見,且發(fā)病率都隨著年齡的增長而增加。盡管老年是心血管疾病和骨質(zhì)疏松共同的危險因素,但大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn),忽略年齡這一因素后,這兩種疾病之間仍存在顯著的聯(lián)系。一方面,心血管系統(tǒng)疾病與骨量丟失及骨折風險增加有關(guān),同樣,有證據(jù)提示骨密度降低可導致心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率增加。進一步研究發(fā)現(xiàn)心血管疾病與骨質(zhì)疏松在發(fā)病機制層面有緊密而直接的聯(lián)系。動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ),而動脈鈣化則是其主要表現(xiàn)之一。動脈鈣化被認為是心血管疾病的一個重要標志物和臨床監(jiān)測指標。研究表明,血管鈣化的本質(zhì)是血管平滑肌細胞向成骨細胞表型的轉(zhuǎn)化以及血管組織向骨組織的轉(zhuǎn)化。而血管鈣化的形成也和骨礦物質(zhì)丟失具有顯著的相關(guān)性。本研究的第二、三和第四部分通過對一組60歲以上老年人群的觀察性研究,探討了老年患者動脈鈣化和骨質(zhì)疏松及骨折之間相關(guān)性。研究方法第一部分1.使用hobs進行成骨誘導培養(yǎng),并于hobs人工過表達hnrnpc1/c2,利用熒光定量pcr(qpcr)檢測1,25(oh)2d誘導的runx2,bglap,spp1及col1a1等成骨標志基因的表達變化。2.使用mg63人成骨細胞系,并以cyp24a1基因為研究對象,采用染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)以及rna免疫共沉淀(rnaimmunoprecipitation,rip)技術(shù),驗證vdr和hnrnpc1/c2與cyp24a1基因上游啟動子區(qū)域vdres以及cyp24a1mrna的相互作用。3.通過rna干擾(rnainterference,rnai)手段在mg63人成骨細胞沉默hnrnpc1/c2,并采用qpcr以及熒光標記pcr,在轉(zhuǎn)錄和剪接水平檢測hnrnpc1/c2沉默對1,25(oh)2d調(diào)控的cyp24a1的基因表達影響。4.最后,通過對mg63成骨細胞的高通量rna測序(rna-seq)結(jié)合生物信息學方法對基因的差異表達及選擇性剪接進行分析,在全基因組水平探討了1,25(oh)2d與hnrnpc1/c2對基因表達和選擇性剪接的作用以及這兩個環(huán)節(jié)之間的相互聯(lián)系。第二部分1.本研究從2012年1月1日到12月31日,篩選60歲以上符合條件的來院就診患者為研究對象。2.主動脈鈣化程度的半定量測量:應(yīng)用腰椎x線側(cè)位片對第1-4腰椎對應(yīng)的腹主動脈鈣化沉積物進行評分。根據(jù)鈣化斑塊的長度和累及的節(jié)段數(shù),每位患者的主動脈鈣化評分(acs)為0-24分不等,無主動脈鈣化是0分,最嚴重的主動脈鈣化是24分。并依據(jù)acs將患者分為4組:g1,acs=0;g2,acs=1-2;g3,acs=3-6;g4,acs6。3.骨密度檢測使用雙能x線吸收儀測量(dxa)。骨質(zhì)疏松癥定義為基于dxa測定的骨密度值低于同性別、同種族正常成年人骨峰值2.5個標準差或以上。4.采用多因素回歸風險模型評估主動脈鈣化和骨質(zhì)疏松癥發(fā)生風險的關(guān)系。第三部分1.與第二部分研究同期,篩選60歲以上符合條件的絕經(jīng)后婦女為研究對象。2.主動脈鈣化程度的半定量測量同第二部分。3.椎骨骨折的診斷:通過x線片觀察椎體形態(tài)(胸4-腰5節(jié)段)確定椎骨骨折的發(fā)生(椎體高度下降20%以上)。4.采用多因素回歸分析模型評估主動脈鈣化和椎骨骨折之間的關(guān)系。第四部分1.與第二部分研究同期,篩選60歲以上符合條件的來院就診患者為研究對象。2.骨密度檢測及骨質(zhì)疏松癥的診斷同第二部分。3.頸動脈和冠狀動脈粥樣硬化鈣化斑塊檢測:使用64排螺旋ct行頸動脈和冠狀動脈cta。三維圖像分析工作站評估所有cta圖像。并對動脈斑塊的成分和發(fā)生范圍進行評價。4.采用多因素回歸風險模型分析骨質(zhì)疏松和骨量丟失與頸動脈和冠狀動脈鈣化斑塊發(fā)生風險之間關(guān)系。結(jié)果第一部分1.hobs過表達hnrnpc1/c2顯著抑制了1,25(oh)2d對成骨細胞骨形成標志基因runx2、bglap的激活。2.mg63成骨細胞中,hnrnpc1/c2與vdr競爭結(jié)合vdres;hnrnpc1/c2與cyp24a1mrna的結(jié)合則與vdr無關(guān)。3.mg63成骨細胞中,hnrnpc1/c2沉默在影響cyp24a1轉(zhuǎn)錄的同時導致cyp24a1異常選擇性剪接的發(fā)生。4.rna-seq檢測基因的差異表達:1,25(oh)2d處理mg63成骨細胞共檢測出324個差異表達基因:其中有187個基因?qū)?,25(oh)2d的反應(yīng)不受hnrnpc1/c2沉默的影響,有137個基因在hnrnpc1/c2沉默后失去對1,25(oh)2d反應(yīng)。而在hnrnpc1/c2沉默后,新出現(xiàn)168個1,25(oh)2d應(yīng)答基因。5.rna-seq檢測基因的選擇性剪接:1,25(oh)2d處理mg63細胞共引起310個選擇性剪接事件;1,25(oh)2d誘導的選擇性剪接事件在hnrnpc1/c2沉默后增加(390個),而只有3個事件(1%)也出現(xiàn)在hnrnpc1/c2存在時1,25(oh)2d誘導所致的選擇性剪接事件中。6.1,25(oh)2d處理導致的324個差異表達基因中,只有9個基因同時出現(xiàn)選擇性剪接。與單獨1,25(oh)2d處理相比較,hnrnpc1/c2沉默聯(lián)合1,25(oh)2d處理導致第三部分有811個基因(22.7%/27.4%)同時出現(xiàn)差異表達和選擇性剪接。第二部分1.1448例完成本項研究的老年受訪者的平均年齡為72.0±4.5歲,有397例(27.4%)發(fā)生了骨質(zhì)疏松癥。2.與無骨質(zhì)疏松癥組相比,骨質(zhì)疏松癥組年齡更加老化、女性更多(p0.01);骨質(zhì)疏松癥組的椎骨、股骨頸、股骨粗隆和全髖部的骨密度更低(p0.01);血清i型原膠原n-端前肽(pinp)、i型膠原交聯(lián)c-末端肽(ctx)水平更高(p0.05);總脫氧吡啶(totaldpd)、游離脫氧吡啶(freedpd)水平更高(p0.01);25羥維生素d[25(oh)d]水平更低(p0.01)。3.在調(diào)整年齡和其他潛在混雜因素以后,acs(g4)、bmd、25(oh)d、ctx、現(xiàn)在吸煙、每日飲酒與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生密切相關(guān)。骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的風險隨著acs的增加而升高,但只在acsg4組與g1組比較有統(tǒng)計學意義。較高的acs在女性和男性均與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生相關(guān)。第三部分1.在1359例絕經(jīng)后婦女中,有173例(12.7%)發(fā)生了骨折,其中包括92例椎骨骨折,81例發(fā)生了非椎骨骨折。2.主動脈鈣化組脊柱骨折的發(fā)生率明顯高于無主動脈鈣化組(p0.01)。3.在調(diào)整年齡等其他混雜因素后,發(fā)現(xiàn)骨密度、年齡、2次及以上跌倒史、25(oh)d、脂聯(lián)素與椎骨骨折密切相關(guān)。與acsg1組相比,g3和g4組椎骨骨折發(fā)生風險更高。第四部分1.1393例老年受訪者完成研究,其中474例發(fā)生動脈鈣化斑塊,包括158例(33.4%)頸動脈鈣化斑塊,195例(41.1%)冠狀動脈鈣化斑塊和121例(25.5%)頸動脈和冠狀動脈共存鈣化斑塊。2.在調(diào)整年齡等其他混雜因素后,骨質(zhì)疏松癥、低骨量、血25(oh)d水平下降與動脈鈣化斑塊的發(fā)生密切相關(guān)。3.在調(diào)整年齡等其它混雜因素后,嚴重的骨量丟失與頸動脈斑塊、冠狀動脈斑塊及共存的鈣化斑塊的發(fā)生均顯著相關(guān)。結(jié)論1.過表達hnrnpc1/c2顯著抑制了1,25(oh)2d對成骨細胞骨形成標志基因runx2、bglap的反式激活;1,25(oh)2d可在轉(zhuǎn)錄和mrna剪接兩個水平調(diào)控成骨細胞基因表達;hnrnpc1/c2可在轉(zhuǎn)錄和mrna剪接水平參與協(xié)調(diào)1,25(oh)2d對成骨細胞的基因表達調(diào)控。2.在老年人群中,嚴重的主動脈鈣化與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生相關(guān)。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生風險隨著ACS的增加而升高。骨密度降低和血25(OH)D水平下降也與骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的相關(guān)。3.在老年絕經(jīng)后婦女中,嚴重的主動脈鈣化與椎骨骨折的發(fā)生相關(guān)。骨密度降低和血25(OH)D水平下降與椎骨骨折的發(fā)生相關(guān)。4.在老年人群中,骨質(zhì)疏松癥、低骨量及血25(OH)D水平下降與動脈鈣化斑塊的發(fā)生相關(guān);嚴重的骨量丟失與頸動脈斑塊、冠狀動脈斑塊及共存的鈣化斑塊的發(fā)生風險均相關(guān)。本研究揭示了維生素D對成骨細胞直接調(diào)控作用的新的分子機制,為認識維生素D在成骨細胞骨分化,骨代謝及代謝性骨病中的作用機制開啟了一個全新的視角,對深入探索骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制,尋找新的藥物治療靶點具有重要意義。同時,對一組老年人群的觀察性研究揭示了老年病的一些共同危險因素及內(nèi)在的相互關(guān)系,對骨質(zhì)疏松癥及心血管疾病的防治具有重要意義。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R580;R543.5

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 連星燁;孟增東;;不同地區(qū)光照量與人體維生素D水平及骨密度之間的關(guān)系[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2012年02期

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本文編號：2329476