【摘要】：研究背景：糖尿病心肌纖維化作為糖尿病的重要并發(fā)癥之一,與心血管疾病的高發(fā)病率和死亡率密切相關(guān)。纖維化以成纖維細(xì)胞積聚及細(xì)胞外基質(zhì)堆積特征,可導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能失調(diào),引起心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。研究指出內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EndMT)在心肌纖維化病理改變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。EndMT是內(nèi)皮細(xì)胞失去其特性(細(xì)胞連接、侵襲、遷移能力等)并轉(zhuǎn)化為間葉細(xì)胞或成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的過(guò)程。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)icroRNA-223在冠狀動(dòng)脈疾病、急性冠脈綜合征、肺動(dòng)脈高壓等多種心血管病中有一定作用,同時(shí)也有資料顯示microRNA-223在胰腺癌中與上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)有關(guān),但microRNA-223是否參與心肌纖維化尚未有確切的研究,本實(shí)驗(yàn)主要探討糖尿病心肌纖維化過(guò)程中miR-223與EndMT的相互關(guān)系及作用機(jī)制。研究目的：(1)研究microRNA-223在心肌纖維化中的作用；(2)研究microRNA-223與EndMT的相關(guān)性及機(jī)理。研究方法：1.細(xì)胞模型的建立：研究指出30mmol/L高糖(HG)可通過(guò)EndMT誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷,而且EndMT可引起心肌纖維化。在本實(shí)驗(yàn)中,選取人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAECs)培養(yǎng),培養(yǎng)基選用內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基ECM,在培養(yǎng)瓶或者六孔板中轉(zhuǎn)入過(guò)表達(dá)病毒LV-hsa-mir-223-3psponge (miR-223)以及陰性對(duì)照病毒,在細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)給予細(xì)胞刺激,即將細(xì)胞分組為NG組、HG組、HG+ miR-223組、HG+ LV-CN組,持續(xù)刺激72小時(shí)后處理細(xì)胞。2. Western Blot:細(xì)胞經(jīng)提取蛋白、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、發(fā)光后觀(guān)察miR-223靶基因PARP-1、EndMT標(biāo)志物(α-SMA, VE-cadherin, eNOS, CD31)以及炎癥標(biāo)志物(TNF-a,VCAM1,ICAM1)的表達(dá)情況。3. RT-PCR:細(xì)胞給予持續(xù)刺激后通過(guò)Trizol法提取RNA、反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增后觀(guān)察高糖刺激后miR-223及靶基因PARP-1表達(dá)量是否有變化,并與轉(zhuǎn)入過(guò)表達(dá)病毒后做對(duì)比。4.細(xì)胞免疫熒光：選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HAECs種在已放入細(xì)胞爬片的24孔板中,經(jīng)一系列反應(yīng)后通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀(guān)察EndMT標(biāo)志物(a-SMA, VE-cadherin, eNOS, CD31)是否有變化以及細(xì)胞形態(tài)等變化。5.細(xì)胞活性檢測(cè)：給予刺激的細(xì)胞通過(guò)CCK-8試劑盒經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞活力,觀(guān)察高糖刺激后細(xì)胞活性是否有改變以及轉(zhuǎn)染病毒后細(xì)胞活力及數(shù)量是否有改善。6.細(xì)胞劃痕試驗(yàn)：在已長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞的六孔板內(nèi)垂直劃三條平行線(xiàn),觀(guān)察內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。7.細(xì)胞transwell試驗(yàn)：計(jì)數(shù)上室細(xì)胞(無(wú)血清培養(yǎng)基)穿過(guò)小室聚碳酸酯膜進(jìn)入下室(有血清培養(yǎng)基)的細(xì)胞數(shù)量,反映內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。8.數(shù)據(jù)分析：運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS 19.0軟件,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,經(jīng)t檢驗(yàn),p0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果：1.MiR-223在經(jīng)高糖誘導(dǎo)的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)與正常糖含量的NG組相比較,主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在經(jīng)高糖刺激后,通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-223在細(xì)胞中的表達(dá)量下降。經(jīng)過(guò)表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染后,miR-223表達(dá)水平升高,陰性對(duì)照組與高糖組比較無(wú)明顯變化。2.MiR-223改善細(xì)胞活力和影響細(xì)胞的遷移能力經(jīng)CCK-8試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn),高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活力下降,而轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)病毒后細(xì)胞活力改善,病毒陰性對(duì)照組較過(guò)表達(dá)組活力較低。Transwell試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖刺激后的內(nèi)皮細(xì)胞穿過(guò)小室的數(shù)量較miR-223過(guò)表達(dá)病毒組明顯增多。為了進(jìn)一步研究主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力,進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。劃痕試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖刺激后的內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力增強(qiáng),距離變窄的速度較miR-223過(guò)表達(dá)病毒組快,與transwell試驗(yàn)結(jié)果相一致。3. PARP-1可能是miR-223的一個(gè)靶基因經(jīng)PCR發(fā)現(xiàn),高糖刺激組PARP-1表達(dá)量升高,miR-223表達(dá)量下降,轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)病毒后miR-223表達(dá)水平提高,而PARP-1表達(dá)水平下降。MiR-223表達(dá)水平與PARP-1呈負(fù)相關(guān)。4.MiR-223可延緩EndMT的進(jìn)展經(jīng)WB及免疫熒光發(fā)現(xiàn),高糖刺激組內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VE-cadherin, eNOS,CD31表達(dá)量下降,而成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)量升高,轉(zhuǎn)染病毒后α-SMA表達(dá)量下降,內(nèi)皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的程度降低。5.MiR-223可減輕炎癥刺激經(jīng)WB發(fā)現(xiàn),高糖刺激內(nèi)皮細(xì)胞后炎癥因子TNF-α,VCAM,ICAM表達(dá)水平升高,轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)病毒后水平下降,減輕炎癥因子對(duì)細(xì)胞的損傷。研究結(jié)論：1.MiR-223過(guò)表達(dá)可通過(guò)作用于靶基因PARP-1延緩EndMT2.MiR-223上調(diào)可改善糖尿病心肌纖維化的程度
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R542.2

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本文編號(hào)：2321411