【摘要】：研究背景：糖尿病心肌纖維化作為糖尿病的重要并發(fā)癥之一,與心血管疾病的高發(fā)病率和死亡率密切相關。纖維化以成纖維細胞積聚及細胞外基質(zhì)堆積特征,可導致心臟結構和功能失調(diào),引起心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。研究指出內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化(EndMT)在心肌纖維化病理改變過程中發(fā)揮重要作用。EndMT是內(nèi)皮細胞失去其特性(細胞連接、侵襲、遷移能力等)并轉(zhuǎn)化為間葉細胞或成纖維細胞樣細胞的過程。文獻報道m(xù)icroRNA-223在冠狀動脈疾病、急性冠脈綜合征、肺動脈高壓等多種心血管病中有一定作用,同時也有資料顯示microRNA-223在胰腺癌中與上皮細胞轉(zhuǎn)化(EMT)有關,但microRNA-223是否參與心肌纖維化尚未有確切的研究,本實驗主要探討糖尿病心肌纖維化過程中miR-223與EndMT的相互關系及作用機制。研究目的：(1)研究microRNA-223在心肌纖維化中的作用；(2)研究microRNA-223與EndMT的相關性及機理。研究方法：1.細胞模型的建立：研究指出30mmol/L高糖(HG)可通過EndMT誘導內(nèi)皮細胞損傷,而且EndMT可引起心肌纖維化。在本實驗中,選取人主動脈內(nèi)皮細胞(HAECs)培養(yǎng),培養(yǎng)基選用內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基ECM,在培養(yǎng)瓶或者六孔板中轉(zhuǎn)入過表達病毒LV-hsa-mir-223-3psponge (miR-223)以及陰性對照病毒,在細胞密度達80%左右時給予細胞刺激,即將細胞分組為NG組、HG組、HG+ miR-223組、HG+ LV-CN組,持續(xù)刺激72小時后處理細胞。2. Western Blot:細胞經(jīng)提取蛋白、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應、發(fā)光后觀察miR-223靶基因PARP-1、EndMT標志物(α-SMA, VE-cadherin, eNOS, CD31)以及炎癥標志物(TNF-a,VCAM1,ICAM1)的表達情況。3. RT-PCR:細胞給予持續(xù)刺激后通過Trizol法提取RNA、反轉(zhuǎn)錄及擴增后觀察高糖刺激后miR-223及靶基因PARP-1表達量是否有變化,并與轉(zhuǎn)入過表達病毒后做對比。4.細胞免疫熒光：選取生長狀態(tài)良好的HAECs種在已放入細胞爬片的24孔板中,經(jīng)一系列反應后通過熒光倒置顯微鏡觀察EndMT標志物(a-SMA, VE-cadherin, eNOS, CD31)是否有變化以及細胞形態(tài)等變化。5.細胞活性檢測：給予刺激的細胞通過CCK-8試劑盒經(jīng)酶標儀檢測細胞活力,觀察高糖刺激后細胞活性是否有改變以及轉(zhuǎn)染病毒后細胞活力及數(shù)量是否有改善。6.細胞劃痕試驗：在已長滿細胞的六孔板內(nèi)垂直劃三條平行線,觀察內(nèi)皮細胞的遷移能力。7.細胞transwell試驗：計數(shù)上室細胞(無血清培養(yǎng)基)穿過小室聚碳酸酯膜進入下室(有血清培養(yǎng)基)的細胞數(shù)量,反映內(nèi)皮細胞的遷移能力。8.數(shù)據(jù)分析：運用統(tǒng)計學SPSS 19.0軟件,數(shù)據(jù)用平均值±標準差(x±s)表示,經(jīng)t檢驗,p0.05有統(tǒng)計學意義。研究結果：1.MiR-223在經(jīng)高糖誘導的主動脈內(nèi)皮細胞中的表達與正常糖含量的NG組相比較,主動脈內(nèi)皮細胞在經(jīng)高糖刺激后,通過PCR技術檢測發(fā)現(xiàn)miR-223在細胞中的表達量下降。經(jīng)過表達病毒轉(zhuǎn)染后,miR-223表達水平升高,陰性對照組與高糖組比較無明顯變化。2.MiR-223改善細胞活力和影響細胞的遷移能力經(jīng)CCK-8試劑盒檢測發(fā)現(xiàn),高糖誘導的內(nèi)皮細胞活力下降,而轉(zhuǎn)染過表達病毒后細胞活力改善,病毒陰性對照組較過表達組活力較低。Transwell試驗發(fā)現(xiàn)高糖刺激后的內(nèi)皮細胞穿過小室的數(shù)量較miR-223過表達病毒組明顯增多。為了進一步研究主動脈內(nèi)皮細胞的遷移能力,進行劃痕實驗。劃痕試驗發(fā)現(xiàn)高糖刺激后的內(nèi)皮細胞遷移能力增強,距離變窄的速度較miR-223過表達病毒組快,與transwell試驗結果相一致。3. PARP-1可能是miR-223的一個靶基因經(jīng)PCR發(fā)現(xiàn),高糖刺激組PARP-1表達量升高,miR-223表達量下降,轉(zhuǎn)染過表達病毒后miR-223表達水平提高,而PARP-1表達水平下降。MiR-223表達水平與PARP-1呈負相關。4.MiR-223可延緩EndMT的進展經(jīng)WB及免疫熒光發(fā)現(xiàn),高糖刺激組內(nèi)皮細胞標志物VE-cadherin, eNOS,CD31表達量下降,而成纖維細胞標志物α-SMA表達量升高,轉(zhuǎn)染病毒后α-SMA表達量下降,內(nèi)皮細胞向成纖維細胞轉(zhuǎn)型的程度降低。5.MiR-223可減輕炎癥刺激經(jīng)WB發(fā)現(xiàn),高糖刺激內(nèi)皮細胞后炎癥因子TNF-α,VCAM,ICAM表達水平升高,轉(zhuǎn)染過表達病毒后水平下降,減輕炎癥因子對細胞的損傷。研究結論：1.MiR-223過表達可通過作用于靶基因PARP-1延緩EndMT2.MiR-223上調(diào)可改善糖尿病心肌纖維化的程度
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R542.2

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