【摘要】：研究背景系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種破壞性的自身免疫性疾病,能損傷多個器官系統(tǒng),以自身抗體產(chǎn)生、免疫復(fù)合物形成、慢性炎癥和終末器官損傷為主要特征�？乖贵w復(fù)合物產(chǎn)生后沉積在小血管、皮膚基底膜、腎臟等各個器官系統(tǒng)。該病的臨床表現(xiàn)主要集中在皮膚、腎臟、肌肉骨骼和血液系統(tǒng),但也可以影響肺部、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、漿膜和幾乎其他所有的器官系統(tǒng)。SLE的流行病學(xué)調(diào)查顯示,世界范圍內(nèi)均有SLE發(fā)生,但在不同國家和地區(qū)間存在明顯差異。我國SLE的患病率較高,且有逐年上升的趨勢。目前,系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)制并沒有研究的十分清楚。一般認(rèn)為SLE受多種因素的影響,包括遺傳基因的影響,生長環(huán)境因素的影響,雌性激素和性別的影響,基因表達(dá)表觀遺傳調(diào)控的影響,免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的影響。由于機(jī)體免疫監(jiān)視或免疫抑制能力的不足,導(dǎo)致體內(nèi)的免疫細(xì)胞持續(xù)處于過度激活狀態(tài),可能在SLE的免疫發(fā)病機(jī)理中起著重要作用。體內(nèi)多種細(xì)胞發(fā)生調(diào)節(jié)異常使得SLE的治療十分困難,因?yàn)閺V泛的免疫抑制必帶來較多的副作用。目前SLE的治療主要采用糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑的使用,這種療法大多數(shù)情況下是有效的,但在一些難治性、重癥紅斑狼瘡的治療中效果不佳且不良反應(yīng)多。為了治愈自身免疫性疾病,我們迫切需要找到一種既能抑制自身免疫細(xì)胞,又能不影響機(jī)體其他的免疫系統(tǒng)工作的新的療法。隨著對自身免疫性疾病的致病機(jī)理的深入了解,越來越多的學(xué)者開始將目光投向干細(xì)胞治療。干細(xì)胞是一類非常與眾不同的細(xì)胞群體。盡管來源不同,干細(xì)胞都有兩個特征性的屬性。首先,在一定條件下,干細(xì)胞具有持續(xù)的、無限制的自我更新能力。其次,干細(xì)胞保留了分化為許多其他特殊類型細(xì)胞的潛能。造血干細(xì)胞(hemopoietic stem cell,HSC)移植是目前應(yīng)用較多的一種干細(xì)胞療法。異體造血干細(xì)胞存在風(fēng)險大、匹配供體尋找難度大、移植后存在免疫排斥反應(yīng)等缺點(diǎn)。為了解決這些難題,研究者們開始尋找其他的干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell,MSC)是一種能分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的多能干細(xì)胞,具有誘導(dǎo)免疫耐受、免疫抑制的作用,且免疫原性低,能夠避免同種異體排斥反應(yīng)。因此移植無需進(jìn)行基因配型,在包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡在內(nèi)的自身免疫性疾病治療方面的有十分廣闊的應(yīng)用前景。最早被認(rèn)識的MSC來源于骨髓,即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC),獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞需要大量的骨髓,給供體帶來了痛苦以及感染的風(fēng)險等,這些限制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用。世界各地的研究者開始尋找新的間充質(zhì)干細(xì)胞來源,包括牙髓組織、臍帶血、胎盤、脂肪等等,這其中脂肪來源最為引人注意。相比于骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞,脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cell, ADSC)或稱脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,擁有來源豐富、易于采集、含量較多、供體所受痛苦小、倫理學(xué)限制少等優(yōu)點(diǎn),是近年來間充質(zhì)干細(xì)胞研究中的主要內(nèi)容。ADSC具有MSC的特性,能分化成骨、軟骨、心肌、平滑肌、脂肪、神經(jīng)及內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞,也具有類似BMSC的免疫調(diào)節(jié)活性。已經(jīng)有一些研究證實(shí)了ADSC在神經(jīng)損傷修復(fù)、心肌損傷修復(fù)、免疫性疾病治療等方面的作用,大多采用人的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。因?yàn)楹罄m(xù)實(shí)驗(yàn)需要用到的狼瘡鼠動物模型是小鼠,所以本實(shí)驗(yàn)采用了同種異基因的小鼠作為提取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的來源。雖然間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療已經(jīng)臨床上有應(yīng)用,但MSC治療的確切機(jī)理還沒有闡述清楚,文獻(xiàn)中報道的機(jī)制包括：MSC的免疫抑制作用是通過活化或促分化Treg細(xì)胞來產(chǎn)生的；MSC通過分泌大量的IL-10或TGF-β1,這些細(xì)胞因子可以讓抗原提呈細(xì)胞的成熟受到抑制,能誘導(dǎo)T細(xì)胞不產(chǎn)生免疫反應(yīng)；MSC可以使活化T細(xì)胞發(fā)生凋亡,同時阻止T細(xì)胞的增殖,來發(fā)揮免疫抑制作用等。自身抗體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者多器官功能障礙中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,抗ds-DNA抗體的升高是判定SLE患者自身免疫活躍的標(biāo)準(zhǔn)之一。本實(shí)驗(yàn)通過觀察抗ds-DNA抗體是否下降來評估ADSC治療狼瘡鼠是否有效。隨著研究的不斷深入,人們認(rèn)識到Th17細(xì)胞及其分泌的特征性細(xì)胞因子IL-17在SLE等自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。IL-17缺失的小鼠不能誘導(dǎo)出以狼瘡抗體表達(dá)升高、狼瘡性腎炎為表現(xiàn)的紅斑狼瘡。那么,ADSC治療能否使狼瘡鼠的IL-17的表達(dá)減少呢?RORyt是調(diào)控Th17細(xì)胞分化及主要效應(yīng)細(xì)胞因子IL-17表達(dá)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。RORyt可通過調(diào)節(jié)IL-17對受Thl7細(xì)胞影響的疾病發(fā)揮作用。是否ADSC是通過RORyt來調(diào)節(jié)IL-17的產(chǎn)生和釋放呢?用于自身免疫病研究的動物模型有很多種類,其中B6.MRL-Faslpr/J小鼠是目前比較常用的研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡的動物模型,小鼠30周齡左右可出現(xiàn)全身性的自身免疫反應(yīng),表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大、腎小球性腎病。本實(shí)驗(yàn)擬通過對系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型鼠進(jìn)行同種異基因脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療,觀察其療效和安全性,從而為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。并通過對相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的研究來探索其可能的作用機(jī)制。目的研究同種異基因脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植對系統(tǒng)性紅斑狼瘡鼠體重、尿蛋白、抗ds-DNA抗體及腎臟的病理變化等主要指標(biāo)的影響,以及對腎臟RORγt、 IL-17mRNA表達(dá)量的影響,探討其在體內(nèi)可能的作用機(jī)制。方法1.采用Ⅰ型膠原酶消化法分離小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,并在體外培養(yǎng)傳代。觀察細(xì)胞形態(tài),取第3代生長良好的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型的鑒定。2.將雌性B6.MRL-Faslpr/J狼瘡鼠分為2組,每組5只(2組動物在分組時體重、尿蛋白濃度無差別)；同齡雌性C57BL/6小鼠5只為正常對照組。ADSC治療組：從32周齡時從尾靜脈注入第1-3代ADSC (0.1X106個細(xì)胞每10g體重),1次/2周,共3次；狼瘡鼠組及正常對照組：以等量的生理鹽水代替ADSC進(jìn)行尾靜脈輸注。3.主要指標(biāo)檢測：考馬斯亮藍(lán)法(Brandford法)檢測尿蛋白濃度；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清抗ds-DNA;常規(guī)組織病理H.E染色觀察小鼠腎臟的病理改變；免疫熒光病理觀察IgG在小鼠腎臟的沉積；實(shí)時熒光PCR檢測腎臟組織中RORγt、IL-17mRNA的表達(dá)。統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(錯誤!未找到引用源�！繱D)表示,統(tǒng)計方法采用單因素方差分析(One-way ANOVA),方差齊時組間比較采用Bonferroni法,方差不齊時組間比較采用Dunnett T3法。當(dāng)P0.05時,差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長,為長梭形或多角形,原代培養(yǎng)時24h-72h內(nèi)貼壁,約10-14d后細(xì)胞融合達(dá)80%以上,排列呈成束狀交織或成漩渦狀。第3代ADSC細(xì)胞表面CD29表達(dá)率為99.66%,CD34表達(dá)率為1.41%,CD45表達(dá)率為0.3%,CD44表達(dá)率為72.58%,CD90表達(dá)率為90.23%,與脂肪間充干細(xì)胞的細(xì)胞表型相符。2.①實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行8周,各組小鼠均未出現(xiàn)死亡,進(jìn)食情況、精神狀況、體重?zé)o明顯差別。②實(shí)驗(yàn)前狼瘡鼠組和ADSC治療組的尿蛋白濃度無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；狼瘡鼠組尿蛋白濃度較正常對照組明顯升高,ADSC治療組的尿蛋白濃度顯著低于狼瘡鼠組(P0.05)。③狼瘡鼠組的血清抗ds-DNA抗體濃度較正常對照組明顯升高,ADSC治療組的血清抗ds-DNA抗體濃度顯著低于狼瘡鼠組(P0.05)。④腎臟病理H.E染色觀察：狼瘡鼠腎小球系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)增生,炎細(xì)胞浸潤；ADSC治療組小鼠腎小球腎炎病理改變較狼瘡鼠組小鼠減輕；正常對照小鼠腎小球系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)無明顯增生。腎臟免疫熒光病理觀察：狼瘡鼠組小鼠的腎小球有較多免疫復(fù)合物沉積；治療組小鼠腎小球免疫復(fù)合物沉積較狼瘡鼠組小鼠減少；正常對照小鼠腎小球無明顯免疫復(fù)合物沉積。3.狼瘡鼠組腎臟IL-17mRNA的表達(dá)量較正常對照組明顯升高,ADSC治療組IL-17mRNA的表達(dá)較狼瘡鼠組降低。狼瘡鼠組腎臟RORymRNA表達(dá)量高于正常對照組,ADSC治療組RORytmRNA的表達(dá)量少于狼瘡鼠組。結(jié)論1.小鼠ADSC能在體外分離培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長,為長梭形或多角形,融合是時排列呈成束狀交織或成漩渦狀。陽性表達(dá)CD29、CD44及CD90,不表達(dá)CD34、CD45等造血干細(xì)胞表面標(biāo)志。2.脂肪間充質(zhì)于細(xì)胞移植可減少B6.MRL-Faslpr/J狼瘡鼠血清自身抗ds-DNA抗體濃度,減輕腎功能損傷所致的蛋白尿及IgG型免疫復(fù)合物在腎臟的沉積,對系統(tǒng)性紅斑狼瘡有治療作用。3. ADSC可能通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子RORyt的表達(dá)來抑制Th17細(xì)胞特征性的細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)和釋放,從而起到治療紅斑狼瘡的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R593.241

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