【摘要】：目的:采用UMR-106大鼠骨肉瘤細(xì)胞和Wistar大鼠為研究對象,從細(xì)胞到整體動物水平,全面分析氟中毒狀態(tài)下,Gs與Gi調(diào)控的Gs-AC-c AMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路各因子的表達(dá)變化,為進(jìn)一步明確Gs-AC-c AMP-PKA信號通路在氟骨癥中的作用奠定基礎(chǔ)。方法:1.氟化鈉對UMR-106細(xì)胞的影響及其與Gs/Gi-AC-c AMP-PKA信號通路表達(dá)的關(guān)系。(1)0、50、100、500、1000、5000、10000、20000、40000、80000mmol/L Na F作用UMR-106細(xì)胞24h、48h,采用CCK-8法檢測細(xì)胞的存活情況,明確后續(xù)實(shí)驗(yàn)作用濃度及時(shí)間。(2)0、1000、2000、4000mmol/L Na F作用UMR-106細(xì)胞24h后,磷酸苯二鈉法檢測ALP活性,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡情況,q RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)BGP、Gs、Gi、AC、PKA m RNA表達(dá)水平。2.氟化鈉對Wistar大鼠骨組織中Gs/Gi-AC-c AMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)影響。48只斷乳2周Wistar大鼠按體重隨機(jī)分為4組,分別為對照組(自來水)和低劑量組(50mg/L Na F)、中劑量組(150 mg/L Na F)、高劑量組(250 mg/L Na F),每組12只,雌雄各半。采用自由飲水方式染毒,連續(xù)染毒6個(gè)月。檢測大鼠尿氟、骨氟、牙氟及血清氟濃度及氟斑牙發(fā)生率;比色法檢測大鼠骨組織中抑制羥自由基能力、CAT、GSH-Px、SOD的活力及ELISA方法檢測8-OHd G、PCO、MDA、Gs、Gi、AC、c AMP、PKA的濃度。結(jié)果:1.氟化鈉對UMR-106細(xì)胞的影響及其與Gs/Gi-AC-c AMP-PKA信號通路表達(dá)的關(guān)系(1)CCK-8檢測結(jié)果:作用24h時(shí),1000~80000μmol/L Na F組UMR-106細(xì)胞存活率較對照組低(P0.05);作用48h時(shí),50~80000μmol/LNa F組UMR-106細(xì)胞存活率較對照組低(P0.05)。確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)作用濃度為0、1000、2000、4000mmol/L,作用時(shí)間為24h。(2)ALP及BGP檢測結(jié)果:各Na F處理組在UMR-106細(xì)胞的培養(yǎng)液及細(xì)胞中的ALP活力均較對照組高(P0.05);2000、4000mmol/L Na F組BGP m RNA相對表達(dá)量較對照組高(P0.05)。(3)細(xì)胞周期及凋亡檢測結(jié)果:1000、4000mmol/L Na F組細(xì)胞數(shù)量在G0/G1期所占比例較對照組低(P0.05),2000mmol/L Na F組細(xì)胞數(shù)量在G0/G1期所占比例高于其余各組(P0.05);2000mmol/L Na F組細(xì)胞數(shù)量在S期所占比例較其余各組低(P0.05);4000mmol/L Na F組細(xì)胞數(shù)量在G2/M期所占比例較其余各組低(P0.05);1000及4000mmol/L Na F組PI較對照組高,2000mmol/L Na F組較對照低(P0.05)。1000mmol/LNa F組凋亡率較對照組低,2000、4000mmol/L Na F組凋亡率較對照組高(P0.05)。(4)Gs、Gi、AC、PKA m RNA表達(dá)檢測結(jié)果:2000mmol/L Na F組PKA、4000mmol/L Na F組Gs及PKA的m RNA相對表達(dá)量較對照組高(P0.05);各實(shí)驗(yàn)組Gi與AC基因m RNA相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.氟化鈉對wistar大鼠骨組織中Gs/Gi-AC-c AMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)影響。(1)氟中毒動物模型建立指標(biāo)檢測結(jié)果:對照組無氟斑牙發(fā)生,各劑量Na F染毒組氟斑牙檢出率為100%;各劑量Na F染毒組大鼠尿氟、牙氟、骨氟、血清氟濃度均較對照組高(P0.05)。(2)大鼠骨組織氧化損傷指標(biāo)檢測結(jié)果:中劑量組大鼠骨組SOD及中、高劑量組CAT、抑制羥自由基能力均較對照組低(P0.05);低劑量大鼠組骨組織GSH-Px高于其余組(P0.05);各劑量組大鼠骨組織PCO高于對照組(P0.05)。各組大鼠骨組織8-OHd G與MDA之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)大鼠骨組織Gs、Gi、AC、c AMP及PKA含量在各Na F染毒組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.氟化鈉可促進(jìn)UMR-106細(xì)胞ALP活性、增加BGP m RNA表達(dá)。2.高濃度氟化鈉可影響UMR-106細(xì)胞周期,延長G0/G1或S期,抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。3.高濃度氟化鈉可增加UMR-106細(xì)胞Gs、PKA m RNA表達(dá)。4.成功建立了慢性氟中毒大鼠模型。5.150、250mg/L Na F可能致大鼠骨組織氧化損傷。6.采用ELISA方法檢測大鼠骨組織Gi/Gs-AC-c AMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路各因子,未在整體水平觀察到表達(dá)變化。
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【學(xué)位授予單位】：貴陽醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R599.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2298558