【摘要】：目的:前期研究發(fā)現(xiàn)溶酶體膜蛋白Sidt2剔出小鼠表現(xiàn)出糖代謝紊亂和胰島素分泌受損,本研究在此基礎(chǔ)上圍繞胰島素分泌相關(guān)蛋白等的檢測來進(jìn)一步探討Sidt2影響胰島素分泌的具體機(jī)制,深化對(duì)溶酶體膜蛋白Sidt2與糖尿病發(fā)病相關(guān)性的認(rèn)識(shí),豐富糖尿病的發(fā)病機(jī)制理論。方法:1、將野生型小鼠與Sidt2~(-/-)小鼠合籠,基因型的鑒定采用鼠尾DNA,接著同籠交配子代Sidt2~(+/-)雜合子小鼠,最后選取子代Sidt2~(-/-)雄鼠為實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組是同窩或者同一個(gè)批次出生的Sidt2~(+/+)野生型雄鼠。進(jìn)行DNA鑒定后行胰島的光學(xué)顯微鏡和解剖顯微鏡觀察。2、檢測Sidt2~(+/+)和Sidt2~(-/-)小鼠的糖耐量。3、對(duì)Sidt2~(+/+)和Sidt2~(-/-)小鼠的胰腺組織進(jìn)行insulin的免疫組化檢測。4、在離體水平通過Western blot檢測小鼠胰島中參與胰島素分泌的關(guān)鍵蛋白:SNAP25、VAMP1、Syntaxin、Syntaxin1的表達(dá)。5、運(yùn)用小干擾RNA技術(shù)在INS1細(xì)胞水平敲降Sidt2,并通過western blot檢測細(xì)胞水平中參與胰島素分泌關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。6、檢測高糖刺激下,Sidt2敲降的INS1細(xì)胞的胰島素分泌情況。7、運(yùn)用過表達(dá)載體在INS1細(xì)胞水平過表達(dá)Sidt2,并通過western blot檢測細(xì)胞水平中參與胰島素分泌關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。8、Sidt2基因啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)三對(duì)引物,分別以98例2型糖尿病患者和67例正常人血清DNA為模板,進(jìn)行PCR,并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,尋找單核苷酸突變位點(diǎn),并對(duì)找到的單核苷酸突變位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:1、從DNA分子水平證明Sidt2~(-/-)基因剔除小鼠模型構(gòu)造是成功的。2、Sidt2~(-/-)小鼠在生長發(fā)育、皮毛的光澤以及應(yīng)激反應(yīng)等一般方面相較于野生型均是落后的。光學(xué)顯微鏡和解剖顯微鏡的觀察發(fā)現(xiàn),對(duì)照組的胰島體積較大、形態(tài)規(guī)則飽滿、數(shù)量較多;而Sidt2~(-/-)小鼠的胰島體積較小、形態(tài)多不規(guī)則、數(shù)量較少。3、免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)Sidt2~(-/-)小鼠胰腺組織的insulin表達(dá)量相較于對(duì)照組的表達(dá)量是降低的(P0.05)。4、Western blot檢測發(fā)現(xiàn)參與胰島素分泌的關(guān)鍵蛋白:SNAP25、VAMP1、Syntaxin的表達(dá)在Sidt2~(-/-)小鼠中相較于野生型小鼠是降低的(P0.05)。5、在大鼠胰島腫瘤細(xì)胞INS1水平上用質(zhì)粒干擾Sidt2的表達(dá),發(fā)現(xiàn)VAMP1的表達(dá)在Sidt2敲降的INS1細(xì)胞中相較于空白對(duì)照組的INS1是降低的(P0.05)。6、在大鼠胰島腫瘤細(xì)胞INS1水平上用過表達(dá)載體過表達(dá)Sidt2,發(fā)現(xiàn)敲降狀態(tài)下的SNAP25、VAMP1、Syntaxin的表達(dá)的下降被糾正了。7、在動(dòng)物水平和細(xì)胞水平兩方面證實(shí)了Sidt2剔除可以導(dǎo)致糖代謝發(fā)生異常。8、發(fā)現(xiàn)三個(gè)單核苷酸突變位點(diǎn):A1521G,G1816A,C502A,其中C502A在2型糖尿病患者和正常對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1、Sidt2~(-/-)可影響小鼠胰島形態(tài),主要表現(xiàn)為胰島細(xì)胞的體積變小、形態(tài)不規(guī)則、胰島數(shù)量減少。2、Sidt2作為多重跨膜溶酶體膜蛋白參與了胰島素顆粒的分泌過程。Sidt2剔除導(dǎo)致糖代謝紊亂并抑制了胰島素分泌的關(guān)鍵囊泡蛋白SNAP25、VAMP1、Syntaxin的表達(dá)進(jìn)而阻礙了胰島素分泌顆粒的正常胞吐,導(dǎo)致胰島細(xì)胞的胰島素分泌障礙,最終進(jìn)入糖尿病階段。3、在細(xì)胞的水平進(jìn)一步驗(yàn)證了Sidt2的缺失對(duì)于SNARE蛋白表達(dá)的下調(diào)作用,并且這種下調(diào)作用可以被外源性轉(zhuǎn)入Sidt2后糾正。4、C502A和中國漢族人群2型糖尿病相關(guān),其中CA基因型可能增加中國漢族人群2型糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R587.1

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本文編號(hào)：2283351