【摘要】：研究背景:在HIV病毒感染靶細胞的過程中,人體內天然存在的多種淀粉樣多肽,如SEVI(精液源性的病毒增強因子),Aβ(老年癡呆蛋白)等可顯著提高病毒感染靶細胞的效率。本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)人工合成的位于gp120MNβ區(qū)的多肽能形成淀粉樣纖維并能促進HIV病毒的感染,提高ARV藥物的IC50。在人體復雜的生理環(huán)境中,是否存在來源于病毒本身的感染增強因素?淀粉樣多肽在HIV感染的過程中是否天然存在?誘導其形成的因素是什么?gp120在體內多種酶的作用下能否降解成為小的多肽片段并產生一定的生理效應?研究目的:擬采用多肽組學結合高分辨質譜法(LC-MS/MS)分別從gp120體外酶解產物,病毒感染靶細胞上清液,HIV陽性患者的血漿及淋巴漏液中尋找HIV包膜蛋白gp120來源的淀粉樣多肽。分別使用免疫熒光,免疫膠體金技術確定病毒感染上清液及患者淋巴漏液中淀粉樣纖維的存在與組成,免疫組化結合剛果紅染色對患者的淋巴結進行分析,確定患者淋巴結中淀粉樣纖維的存在與組成。通過病毒感染增強實驗評價所鑒定的多肽對病毒感染靶細胞及臨床抗病毒藥物IC50的影響。本研究為深入理解HIV病毒的非基因耐藥新機制,優(yōu)化HIV臨床治療方案提供理論參考。方法與結果:為檢測體液中酶對gp120穩(wěn)定性的影響,分別選用α-L-AFU、Thrombin B、Plasmin、CathepsinB四種酶對gp120JRFL蛋白進行體外酶促反應,10%SDS-PAGE電泳結合考馬斯亮藍染色發(fā)現(xiàn)gp120蛋白在不同時間點均存在不同程度降解,透射電鏡(TEM)下酶解產物可自發(fā)形成淀粉樣纖維。為驗證HIV病毒感染靶細胞的過程中能否自發(fā)產生gp120來源的多肽,我們在體外模擬了病毒體內的感染過程。分別采用不同嗜性病毒X4嗜性(HIVIIIB)感染MT-2細胞及R5嗜性(HIVSF162)病毒感染CEMx174 5.25M7細胞,感染7天后離心除去細胞及細胞碎片收取上清。免疫熒光及免疫膠體金法檢測到感染上清中存在gp120來源的淀粉樣纖維。為驗證臨床樣本中是否存在gp120來源多肽,是否存在促進病毒感染的因素。免疫熒光與免疫膠體金檢測到淋巴漏液中存在gp120來源的淀粉樣纖維。免疫組化與剛果紅染色實驗表明HIV陽性患者淋巴結中gp120蛋白表達量較高且與淀粉樣物質存在共定位。進一步實驗發(fā)現(xiàn)滅活的淋巴漏液可以濃度依賴性的促進R5嗜性(HIVSF162)克隆病毒感染靶細胞。為鑒定多肽具體序列,分別使用超濾法處理gp120體外酶解產物,OMC材料吸附,免疫親和,乙腈沉淀法結合超濾法對感染上清,淋巴漏液進行樣本預處理。高分辨質譜LC-MS/MS鑒定并發(fā)現(xiàn)了一系列gpl20來源多肽。序列同源比對分析多肽在gp120上的定位及可能的二級結構,選擇性合成了具有β結構域的部分多肽。采用剛果紅,硫磺素T特異性染色,透射電鏡TEM,圓二色譜CD等驗證多肽是否可形成淀粉樣纖維并具有典型的β折疊。病毒感染活性實驗表明 GAP380-396、GAP229-244、GAP354-369 多肽對克隆病毒,GAP380-396、GAP229-244多肽對臨床株病毒具有感染增強作用。GAP380-396、GAP229-244多肽使四種臨床抗病毒藥物的IC50升高。為解析多肽增強病毒感染的機制,用Zetasizer Nano ZS電勢測量儀檢測了GAP380-396、GAP229-244多肽的電勢,競爭性結合實驗檢測了電荷因素對病毒感染的作用。發(fā)現(xiàn)CS對帶有正電荷的GAP229-244多肽的病毒增強感染能力具有部分拮抗作用,對負電荷GAP380-396及幾乎不帶電荷的EP2多肽無影響。采用Virus pull-down進一步檢測多肽纖維沉淀與上清對病毒的感染性,發(fā)現(xiàn)僅有沉淀部分可增強病毒感染,說明多肽纖維可捕獲并結合病毒。Cell-binding及熒光病毒結合實驗發(fā)現(xiàn)多肽可通過結合病毒與細胞膜來增強病毒感染。熒光多肽顯示不同多肽之間可形成雜合多肽且仍保持增強病毒感染能力,多肽之間可能具有疊加效應。XTT實驗顯示多肽與病毒對Tzm-bl細胞無毒性。結論:分別從HIV gp120的體外酶解產物,感染上清,臨床樣本淋巴漏液中鑒定出來源于gp120β-片層能形成淀粉樣纖維的多肽GAPs及能促進病毒感染的淀粉樣纖維GEVI。體液中存在的酶的催化作用可能是gp120降解形成多肽的原因之一。GAPs多肽可促進HIV病毒感染及并拮抗抗病毒藥物活性,且不同多肽之間具有增強感染的疊加效應。這種感染增強效應可能是靜電及其疏水效應共同作用的結果。本研究為深入理解HIV病毒感染增強效應,非基因突變引發(fā)的耐藥問題提供理論依據(jù),為HIV的臨床治療提供了改進方向。
[Abstract]:BACKGROUND: Many amyloid peptides, such as SEVI (semen-derived viral enhancer factor) and A-beta (alzheimer's disease protein), can significantly improve the efficiency of HIV infection in target cells. In our previous study, we found that synthetic peptides located in gp120MN-beta region can form. Amyloid fibers can promote HIV infection and increase IC50 of ARV drugs. Is there an infection-enhancing factor originating from the virus itself in the complex physiological environment of the human body? Is amyloid polypeptides present naturally in the process of HIV infection? What are the factors inducing the formation of amyloid polypeptides? Can gp120 be reduced by a variety of enzymes in the body? Objective: To search for amyloid peptides from the enzymatic hydrolysate of gp120 in vitro, the supernatant of target cells infected by virus, the plasma and lymphatic leak of HIV-positive patients, respectively, by using high resolution mass spectrometry (LC-MS/MS). The presence and composition of amyloid fibers in virus infection supernatant and lymphatic leak were determined by fluorescence and immunogold assay. The presence and composition of amyloid fibers in lymph nodes were determined by immunohistochemistry combined with Congo red staining. Methods and Results: In order to detect the influence of enzymes in body fluid on the stability of gp120, four enzymes, alpha-L-AFU, Thrombin B, Plasmin and CathepsinB, were used to determine the stability of gp120 JR. FL protein was enzymatically hydrolyzed in vitro. 10% SDS-PAGE electrophoresis combined with Coomassie brilliant blue staining showed that gp120 protein was degraded in varying degrees at different time points, and amyloid fibers could be formed spontaneously by enzymatic hydrolysates under transmission electron microscopy (TEM). The infection process in vivo was simulated in vitro. MT-2 cells and CEMx174 5.25M7 cells were infected with different trophotropic viruses X4 (HIVIIIB) and R5 (HIV SF162) respectively. After 7 days of infection, CEMx174 5.25M7 cells were centrifuged to remove cells and cell debris for supernatant collection. Immunohistochemistry and Congo red staining showed that the expression of gp120 protein in lymph nodes of HIV-positive patients was higher than that in lymph nodes of HIV-positive patients. It was found that inactivated lymphatic leakage could promote R5 tropism (HIV SF162) in a concentration-dependent manner. To identify the specific sequence of the polypeptide, the enzymatic hydrolysates of gp120 were treated by ultrafiltration, OMC adsorption, immunoaffinity, acetonitrile precipitation and ultrafiltration respectively. A series of polypeptides derived from gpl20 were identified by high resolution mass spectrometry LC-MS/MS. Homology alignment analysis showed that the polypeptides were localized on gp120 and possibly secondary structures. Some polypeptides with beta domain were selectively synthesized. Specific staining of Congo red, sulfur T, TEM and circular dichroism were used. The results of virus infection activity test showed that GAP380-396, GAP229-244, GAP354-369 polypeptides could enhance the infection of cloned viruses, GAP380-396, GAP229-244 polypeptides to clinical strains of viruses. GAP380-396, GAP229-244 polypeptides increased the IC50 level of four clinical antiviral drugs. In order to elucidate the mechanism of polypeptide-enhanced viral infection, the potential of GAP380-396 and GAP229-244 peptides was detected by Zetasizer Nano-ZS potentiometer, and the effect of charge factor on viral infection was tested by competitive binding assay. Virus pull-down was used to further detect the viral infectivity of polypeptide fiber precipitation and supernatant. It was found that only part of the precipitation could enhance viral infection, indicating that polypeptide fibers could capture and bind to viruses. Cell-binding and fluorescent viral binding experiments showed that polypeptides could bind to viruses. The fluorescent polypeptides showed that different peptides could form heterozygous polypeptides and still enhance the viral infection ability. The polypeptides may have superposition effect. XTT test showed that the polypeptides and viruses were non-toxic to Tzm-bl cells. Conclusion: The enzymatic hydrolysates of HIV gp120 in vitro, the supernatants of HIV gp120 infection, and clinical samples were obtained. The polypeptide GAPs derived from gp120 beta-lamellar amyloid fibers and the amyloid fibers GEVI that can promote virus infection were identified in the lymphatic leakage. The catalysis of enzymes in body fluid may be one of the reasons for the degradation of gp120 to form polypeptides. GAPs can promote HIV infection and antagonize the activity of antiviral drugs, and different polypeptides can promote the degradation of gp120 to form polypeptides. This study provides a theoretical basis for further understanding of HIV infection enhancement effect and drug resistance caused by non-gene mutation, and provides a direction for clinical treatment of HIV.
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R512.91

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 周雪艷,胡宏;不同地區(qū)人群TT病毒感染的分布[J];國外醫(yī)學.臨床生物化學與檢驗學分冊;2000年06期

2 梁建華,李萬仲;病毒感染后低血鉀麻痹39例[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志;2000年14期

3 金皎,王鑒,張力;EB病毒感染兒童31例臨床分析[J];貴州醫(yī)藥;2001年06期

4 Gisserot O.;Landais C.;Cremades S.;J.P.De Jaureguiberry;郭戰(zhàn)宏;;1例EB病毒感染的8歲女童的急性腹痛[J];世界核心醫(yī)學期刊文摘(兒科學分冊);2005年07期

5 郭秀嬋;;B病毒感染及防治[J];病毒學報;2005年06期

6 ;病毒感染相關疾病名詞[J];現(xiàn)代護理;2006年04期

7 沈若川;;境外艾滋病患者和病毒感染者入境后的醫(yī)學監(jiān)管[J];中國公共衛(wèi)生管理;2010年04期

8 劉育希,董文平,李寧,陳荷英,李挺秀,石澤雷;龍勝縣少數(shù)民族兒童的EB病毒感染情況的調查[J];癌癥;1984年02期

9 閻輝;;δ病毒感染調查:一種可能的流行病學模式[J];國外醫(yī)學.流行病學傳染病學分冊;1988年03期

10 Schuster V;蘭節(jié);;小兒EB病毒感染的診斷和治療[J];國外醫(yī)學(流行病學傳染病學分冊);1993年03期

相關會議論文 前10條

1 魏文憑;;小兒EB病毒感染的臨床觀察及治療[A];第六屆江浙滬兒科學術會議暨兒科學基礎與臨床研究進展學術班論文匯編[C];2009年

2 饒軍華;劉曉明;王海英;多海剛;田克恭;;預防和治療B病毒感染的方法[A];中國實驗動物學會第六屆學術年會論文集[C];2004年

3 鄭靜;邱艷;高波;夏紅英;;北京地區(qū)獻血者HIV病毒感染狀況調查研究[A];中國輸血協(xié)會第三屆輸血大會論文專輯[C];2004年

4 張潔;張小艷;;西安市2000-2006年病毒感染患者病原抗體檢測分析[A];中國免疫學會第五屆全國代表大會暨學術會議論文摘要[C];2006年

5 張慧;李雙杰;袁遠宏;;兒童EB病毒感染不同臨床類型免疫功能的研究[A];中華醫(yī)學會第十七次全國兒科學術大會論文匯編（上冊）[C];2012年

6 ;EB病毒感染與血液疾病[A];2013年國家級“惡性血液系統(tǒng)疾病診治新進展”學習班暨學術年會資料匯編[C];2013年

7 劉業(yè)強;吳飛;莫小輝;張黎明;蔡啟良;;EB病毒感染相關的皮膚病[A];2014全國中西醫(yī)結合皮膚性病學術年會論文匯編[C];2014年

8 張慧;李雙杰;袁遠宏;唐蓮;姚娟;;兒童EB病毒感染不同臨床類型免疫功能研究[A];中華醫(yī)學會第十七次全國兒科學術大會論文匯編（上冊）[C];2012年

9 楊占秋;;病毒感染的生態(tài)學[A];湖北省暨武漢市微生物學會分析微生物專業(yè)委員會第十屆第五次學術會議論文匯編[C];2008年

10 甄小芳;;中藥治療急性EB病毒感染的研究[A];第二十九次全國中醫(yī)兒科學術大會暨“小兒感染性疾病的中醫(yī)藥防治”培訓班論文匯編[C];2012年

相關重要報紙文章 前10條

1 ;云南：在“家”字上著力開展防艾禁毒活動[N];中國婦女報;2009年

2 常麗君;700年前病毒感染了活植物[N];科技日報;2014年

3 健康時報特約記者　姚麗萍;病毒感染能導致肥胖[N];健康時報;2005年

4 記者 朱玉;男性為主 青壯年為主[N];新華每日電訊;2001年

5 戴欣 李媛媛;首屆全國病毒感染與器官功能衰竭研討會召開[N];科技日報;2012年

6 錢峰 鄭靈巧;確保艾滋病人及家庭得到幫扶[N];健康報;2006年

7 王振嶺;春季當防病毒感染[N];中國中醫(yī)藥報;2006年

8 孫剛;上海新報告病毒感染者582例[N];解放日報;2007年

9 記者 蔣仕麗;云南做細染艾者關懷救助工作[N];健康報;2012年

10 吳錚;美國專家稱“病毒感染”可引起肥胖[N];醫(yī)藥經濟報;2005年

相關博士學位論文 前10條

1 徐嬌;抗鴨瘟病毒活性物質的篩選及白藜蘆醇抗鴨瘟病毒活性與作用機制研究[D];四川農業(yè)大學;2014年

2 李雯娟;HIV-1 gp120來源的天然降解淀粉樣多肽的發(fā)現(xiàn)及其促進HIV-1感染的研究[D];南方醫(yī)科大學;2017年

3 王開發(fā);病毒感染動力學模型分析[D];西南大學;2007年

4 毛曉健;2005-2007年廣州兒童醫(yī)院住院肺炎患兒三種病毒感染的臨床特征[D];南方醫(yī)科大學;2010年

5 張宜娜;病毒感染與PDK1 SUMO化修飾的互作研究[D];浙江大學;2016年

6 張穎;淋巴細胞HIV-1輔受體的表型剔除對病毒感染的阻斷作用[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學;2003年

7 李建蓉;靜脈藥癮者T細胞亞群變化與多重病毒感染關系的研究[D];華中科技大學;2006年

8 陳玉會;Heterotypic cell-in-cell結構在炎癥、癌癥以及病毒感染與傳播中相關機制的研究[D];華南理工大學;2013年

9 孫利;CD34~+人造血干細胞（hHSC）HIV-1輔受體的表型剔除對病毒感染的阻斷作用[D];第四軍醫(yī)大學;2008年

10 黎耀強;中醫(yī)治療艾滋病研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2004年

相關碩士學位論文 前10條

1 楊益;廣譜病毒感染抑制劑的篩選及其作用機制的初步研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2015年

2 王玲玲;155例EB病毒感染住院患兒的臨床特點和實驗室檢查分析[D];山西醫(yī)科大學;2015年

3 孫巧麗;湖北省艾滋病病毒感染者/病人歧視現(xiàn)狀及其就醫(yī)告知情況研究[D];武漢科技大學;2015年

4 閆艷;胞外ADP在病毒感染中的功能和機制研究[D];華東師范大學;2015年

5 姚瑤;TSG-6對HCMV感染引起的TNF-α和IL-6表達水平下調的研究[D];安徽醫(yī)科大學;2016年

6 梁姝怡;發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒感染狀況調查及其傳播媒介初步研究[D];南京醫(yī)科大學;2014年

7 王輝;二倍體細胞的酶活性動力學及其病毒感染生物學反應特征的相關分析[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2016年

8 馬帥;EBV感染成人臨床特點分析及免疫功能評價[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2016年

9 萬佳;天然免疫相關因子對SFTS病毒感染的作用研究[D];中國疾病預防控制中心;2016年

10 李志騰;IncRNA與mRNA在雞ALV-J病毒感染中的表達規(guī)律研究[D];揚州大學;2016年

，

本文編號：2250096