【摘要】：研究背景:在HIV病毒感染靶細(xì)胞的過(guò)程中,人體內(nèi)天然存在的多種淀粉樣多肽,如SEVI(精液源性的病毒增強(qiáng)因子),Aβ(老年癡呆蛋白)等可顯著提高病毒感染靶細(xì)胞的效率。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)人工合成的位于gp120MNβ區(qū)的多肽能形成淀粉樣纖維并能促進(jìn)HIV病毒的感染,提高ARV藥物的IC50。在人體復(fù)雜的生理環(huán)境中,是否存在來(lái)源于病毒本身的感染增強(qiáng)因素?淀粉樣多肽在HIV感染的過(guò)程中是否天然存在?誘導(dǎo)其形成的因素是什么?gp120在體內(nèi)多種酶的作用下能否降解成為小的多肽片段并產(chǎn)生一定的生理效應(yīng)?研究目的:擬采用多肽組學(xué)結(jié)合高分辨質(zhì)譜法(LC-MS/MS)分別從gp120體外酶解產(chǎn)物,病毒感染靶細(xì)胞上清液,HIV陽(yáng)性患者的血漿及淋巴漏液中尋找HIV包膜蛋白gp120來(lái)源的淀粉樣多肽。分別使用免疫熒光,免疫膠體金技術(shù)確定病毒感染上清液及患者淋巴漏液中淀粉樣纖維的存在與組成,免疫組化結(jié)合剛果紅染色對(duì)患者的淋巴結(jié)進(jìn)行分析,確定患者淋巴結(jié)中淀粉樣纖維的存在與組成。通過(guò)病毒感染增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)所鑒定的多肽對(duì)病毒感染靶細(xì)胞及臨床抗病毒藥物IC50的影響。本研究為深入理解HIV病毒的非基因耐藥新機(jī)制,優(yōu)化HIV臨床治療方案提供理論參考。方法與結(jié)果:為檢測(cè)體液中酶對(duì)gp120穩(wěn)定性的影響,分別選用α-L-AFU、Thrombin B、Plasmin、CathepsinB四種酶對(duì)gp120JRFL蛋白進(jìn)行體外酶促反應(yīng),10%SDS-PAGE電泳結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)gp120蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)均存在不同程度降解,透射電鏡(TEM)下酶解產(chǎn)物可自發(fā)形成淀粉樣纖維。為驗(yàn)證HIV病毒感染靶細(xì)胞的過(guò)程中能否自發(fā)產(chǎn)生gp120來(lái)源的多肽,我們?cè)隗w外模擬了病毒體內(nèi)的感染過(guò)程。分別采用不同嗜性病毒X4嗜性(HIVIIIB)感染MT-2細(xì)胞及R5嗜性(HIVSF162)病毒感染CEMx174 5.25M7細(xì)胞,感染7天后離心除去細(xì)胞及細(xì)胞碎片收取上清。免疫熒光及免疫膠體金法檢測(cè)到感染上清中存在gp120來(lái)源的淀粉樣纖維。為驗(yàn)證臨床樣本中是否存在gp120來(lái)源多肽,是否存在促進(jìn)病毒感染的因素。免疫熒光與免疫膠體金檢測(cè)到淋巴漏液中存在gp120來(lái)源的淀粉樣纖維。免疫組化與剛果紅染色實(shí)驗(yàn)表明HIV陽(yáng)性患者淋巴結(jié)中g(shù)p120蛋白表達(dá)量較高且與淀粉樣物質(zhì)存在共定位。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)滅活的淋巴漏液可以濃度依賴性的促進(jìn)R5嗜性(HIVSF162)克隆病毒感染靶細(xì)胞。為鑒定多肽具體序列,分別使用超濾法處理gp120體外酶解產(chǎn)物,OMC材料吸附,免疫親和,乙腈沉淀法結(jié)合超濾法對(duì)感染上清,淋巴漏液進(jìn)行樣本預(yù)處理。高分辨質(zhì)譜LC-MS/MS鑒定并發(fā)現(xiàn)了一系列g(shù)pl20來(lái)源多肽。序列同源比對(duì)分析多肽在gp120上的定位及可能的二級(jí)結(jié)構(gòu),選擇性合成了具有β結(jié)構(gòu)域的部分多肽。采用剛果紅,硫磺素T特異性染色,透射電鏡TEM,圓二色譜CD等驗(yàn)證多肽是否可形成淀粉樣纖維并具有典型的β折疊。病毒感染活性實(shí)驗(yàn)表明 GAP380-396、GAP229-244、GAP354-369 多肽對(duì)克隆病毒,GAP380-396、GAP229-244多肽對(duì)臨床株病毒具有感染增強(qiáng)作用。GAP380-396、GAP229-244多肽使四種臨床抗病毒藥物的IC50升高。為解析多肽增強(qiáng)病毒感染的機(jī)制,用Zetasizer Nano ZS電勢(shì)測(cè)量?jī)x檢測(cè)了GAP380-396、GAP229-244多肽的電勢(shì),競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了電荷因素對(duì)病毒感染的作用。發(fā)現(xiàn)CS對(duì)帶有正電荷的GAP229-244多肽的病毒增強(qiáng)感染能力具有部分拮抗作用,對(duì)負(fù)電荷GAP380-396及幾乎不帶電荷的EP2多肽無(wú)影響。采用Virus pull-down進(jìn)一步檢測(cè)多肽纖維沉淀與上清對(duì)病毒的感染性,發(fā)現(xiàn)僅有沉淀部分可增強(qiáng)病毒感染,說(shuō)明多肽纖維可捕獲并結(jié)合病毒。Cell-binding及熒光病毒結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多肽可通過(guò)結(jié)合病毒與細(xì)胞膜來(lái)增強(qiáng)病毒感染。熒光多肽顯示不同多肽之間可形成雜合多肽且仍保持增強(qiáng)病毒感染能力,多肽之間可能具有疊加效應(yīng)。XTT實(shí)驗(yàn)顯示多肽與病毒對(duì)Tzm-bl細(xì)胞無(wú)毒性。結(jié)論:分別從HIV gp120的體外酶解產(chǎn)物,感染上清,臨床樣本淋巴漏液中鑒定出來(lái)源于gp120β-片層能形成淀粉樣纖維的多肽GAPs及能促進(jìn)病毒感染的淀粉樣纖維GEVI。體液中存在的酶的催化作用可能是gp120降解形成多肽的原因之一。GAPs多肽可促進(jìn)HIV病毒感染及并拮抗抗病毒藥物活性,且不同多肽之間具有增強(qiáng)感染的疊加效應(yīng)。這種感染增強(qiáng)效應(yīng)可能是靜電及其疏水效應(yīng)共同作用的結(jié)果。本研究為深入理解HIV病毒感染增強(qiáng)效應(yīng),非基因突變引發(fā)的耐藥問(wèn)題提供理論依據(jù),為HIV的臨床治療提供了改進(jìn)方向。
[Abstract]:BACKGROUND: Many amyloid peptides, such as SEVI (semen-derived viral enhancer factor) and A-beta (alzheimer's disease protein), can significantly improve the efficiency of HIV infection in target cells. In our previous study, we found that synthetic peptides located in gp120MN-beta region can form. Amyloid fibers can promote HIV infection and increase IC50 of ARV drugs. Is there an infection-enhancing factor originating from the virus itself in the complex physiological environment of the human body? Is amyloid polypeptides present naturally in the process of HIV infection? What are the factors inducing the formation of amyloid polypeptides? Can gp120 be reduced by a variety of enzymes in the body? Objective: To search for amyloid peptides from the enzymatic hydrolysate of gp120 in vitro, the supernatant of target cells infected by virus, the plasma and lymphatic leak of HIV-positive patients, respectively, by using high resolution mass spectrometry (LC-MS/MS). The presence and composition of amyloid fibers in virus infection supernatant and lymphatic leak were determined by fluorescence and immunogold assay. The presence and composition of amyloid fibers in lymph nodes were determined by immunohistochemistry combined with Congo red staining. Methods and Results: In order to detect the influence of enzymes in body fluid on the stability of gp120, four enzymes, alpha-L-AFU, Thrombin B, Plasmin and CathepsinB, were used to determine the stability of gp120 JR. FL protein was enzymatically hydrolyzed in vitro. 10% SDS-PAGE electrophoresis combined with Coomassie brilliant blue staining showed that gp120 protein was degraded in varying degrees at different time points, and amyloid fibers could be formed spontaneously by enzymatic hydrolysates under transmission electron microscopy (TEM). The infection process in vivo was simulated in vitro. MT-2 cells and CEMx174 5.25M7 cells were infected with different trophotropic viruses X4 (HIVIIIB) and R5 (HIV SF162) respectively. After 7 days of infection, CEMx174 5.25M7 cells were centrifuged to remove cells and cell debris for supernatant collection. Immunohistochemistry and Congo red staining showed that the expression of gp120 protein in lymph nodes of HIV-positive patients was higher than that in lymph nodes of HIV-positive patients. It was found that inactivated lymphatic leakage could promote R5 tropism (HIV SF162) in a concentration-dependent manner. To identify the specific sequence of the polypeptide, the enzymatic hydrolysates of gp120 were treated by ultrafiltration, OMC adsorption, immunoaffinity, acetonitrile precipitation and ultrafiltration respectively. A series of polypeptides derived from gpl20 were identified by high resolution mass spectrometry LC-MS/MS. Homology alignment analysis showed that the polypeptides were localized on gp120 and possibly secondary structures. Some polypeptides with beta domain were selectively synthesized. Specific staining of Congo red, sulfur T, TEM and circular dichroism were used. The results of virus infection activity test showed that GAP380-396, GAP229-244, GAP354-369 polypeptides could enhance the infection of cloned viruses, GAP380-396, GAP229-244 polypeptides to clinical strains of viruses. GAP380-396, GAP229-244 polypeptides increased the IC50 level of four clinical antiviral drugs. In order to elucidate the mechanism of polypeptide-enhanced viral infection, the potential of GAP380-396 and GAP229-244 peptides was detected by Zetasizer Nano-ZS potentiometer, and the effect of charge factor on viral infection was tested by competitive binding assay. Virus pull-down was used to further detect the viral infectivity of polypeptide fiber precipitation and supernatant. It was found that only part of the precipitation could enhance viral infection, indicating that polypeptide fibers could capture and bind to viruses. Cell-binding and fluorescent viral binding experiments showed that polypeptides could bind to viruses. The fluorescent polypeptides showed that different peptides could form heterozygous polypeptides and still enhance the viral infection ability. The polypeptides may have superposition effect. XTT test showed that the polypeptides and viruses were non-toxic to Tzm-bl cells. Conclusion: The enzymatic hydrolysates of HIV gp120 in vitro, the supernatants of HIV gp120 infection, and clinical samples were obtained. The polypeptide GAPs derived from gp120 beta-lamellar amyloid fibers and the amyloid fibers GEVI that can promote virus infection were identified in the lymphatic leakage. The catalysis of enzymes in body fluid may be one of the reasons for the degradation of gp120 to form polypeptides. GAPs can promote HIV infection and antagonize the activity of antiviral drugs, and different polypeptides can promote the degradation of gp120 to form polypeptides. This study provides a theoretical basis for further understanding of HIV infection enhancement effect and drug resistance caused by non-gene mutation, and provides a direction for clinical treatment of HIV.
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R512.91

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本文編號(hào)：2250096