發(fā)布時(shí)間：2018-08-25 16:30

【摘要】：目的:本文觀察絲裂霉素C能否抑制體外培養(yǎng)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡,并初步探討誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。方法:1、取類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織進(jìn)行原代細(xì)胞的分離及培養(yǎng),并通過倒置相差顯微鏡觀察觀察滑膜成纖維細(xì)胞的形態(tài)。2、分別采用不同濃度的MMC(0、10、25、50、100 mg/L)處理FLS不同時(shí)間(0、6、12、24、48 h)后用CCK-8比色法檢測(cè)MMC對(duì)FLS增殖活性的影響。應(yīng)用50 mg/L MMC處理FLS不同時(shí)間(0、6、12、24、48 h)后用流式細(xì)胞儀及原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)MMC對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)50 mg/L MMC作用FLS不同時(shí)間(0、1、3、6、12、24 h)后對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的影響,通過Western blot法檢測(cè)線粒體凋亡蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1、絲裂霉素C對(duì)FLS增殖的影響:CCK-8法結(jié)果顯示絲裂霉素C可呈時(shí)間和劑量依賴性抑制RA FLS的增殖,其中當(dāng)50 mg/L MMC作用FLS 24 h細(xì)胞存活率約為50%。2、絲裂霉素C可誘導(dǎo)FLS發(fā)生凋亡:流式細(xì)胞儀AV/PI雙染法結(jié)果顯示經(jīng)50 mg/L MMC處理0、6、12、24、48 h后,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡率逐漸增加,凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示MMC處理FLS 12 h以上細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。此外,我們還采用TUNEL法來檢測(cè)RA FLS的凋亡,FLS經(jīng)50 mg/L MMC作用不同時(shí)間后,TUNEL的陽(yáng)性率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、絲裂霉素C對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的影響:經(jīng)50 mg/L MMC處理FLS不同時(shí)間(0、1、3、6、12、24 h)后,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、絲裂霉素C對(duì)RA FLS線粒體功能以及線粒體凋亡相關(guān)蛋白的影響:為研究MMC導(dǎo)致的RA FLS凋亡后是否與細(xì)胞線粒體功能障礙有關(guān),我們采用JC-1免疫熒光染色法來檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,Δψm)的改變。經(jīng)MMC處理后,熒光結(jié)果顯示FLS線粒體膜電位降低。此外,Western blot結(jié)果顯示50mg/L MMC處理RA FLS可增加Bax蛋白的表達(dá)水平,降低Bcl-2蛋白的表達(dá)水平,并促進(jìn)Caspase-9、Caspase-3以及PARP的活化裂解(P0.05),且呈時(shí)間依賴性。我們進(jìn)一步檢測(cè)了從線粒體內(nèi)向細(xì)胞漿中釋放的細(xì)胞色素C的含量,結(jié)果顯示經(jīng)MMC作用后細(xì)胞漿中細(xì)胞色素C的含量明顯增加,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、絲裂霉素C可在體外抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的增殖,且呈時(shí)間和劑量依賴性。2、絲裂霉素C可誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡。3、絲裂霉素C可能是通過線粒體途徑誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:Aim: to investigate whether mitomycin C can inhibit the proliferation and induce apoptosis of synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis in vitro and to explore the mechanism of inducing apoptosis. Methods the synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis was isolated and cultured. The morphology of synovial fibroblasts was observed by inverted phase contrast microscope. The effect of MMC on the proliferation of FLS was detected by CCK-8 colorimetric assay after FLS was treated with different concentrations of MMC (01010U 2550100 mg/L) for 48 h. The effect of MMC on apoptosis was detected by flow cytometry (FCM) and in situ terminal transferase labeling (TUNEL) after 50 mg/L MMC treatment of FLS for 48 h. Flow cytometry (FCM) was used to detect the effects of 50 mg/L MMC on the production of reactive oxygen species (Ros) in the cells at different time points (0 ~ (-1) and 12 ~ (12) h, and the expression of mitochondrial apoptotic protein was detected by Western blot method. Results the effect of mitomycin C on the proliferation of FLS showed that mitomycin C could inhibit the proliferation of RA FLS in a time-and dose-dependent manner. The survival rate of FLS cells treated with 50 mg/L MMC for 24 h was about 50. 2, mitomycin C could induce apoptosis of FLS. The results of flow cytometry AV/PI double staining showed that after 50 mg/L MMC treatment, the apoptotic rate increased gradually with the prolongation of treatment time. Apoptotic cell count showed that the apoptosis rate of FLS treated with MMC for more than 12 h was significantly higher than that of control group (P0.05). In addition, TUNEL assay was used to detect the positive rate of Tunel in RA FLS treated with 50 mg/L MMC for different time, and the positive rate of Tunel increased with the prolongation of time. The effect of mitomycin C on the production of reactive oxygen species (Ros): after 50 mg/L MMC treatment of FLS for 24 h, flow cytometry showed that the results of flow cytometry were higher than those of control group. In the experimental group, the production of reactive oxygen species increased significantly. The effect of mitomycin C on mitochondrial function of RA FLS and mitochondrial apoptosis-related protein: in order to study whether the apoptosis of RA FLS induced by MMC is related to mitochondrial dysfunction, the difference was statistically significant (P0.05) .4. The changes of mitochondrial membrane potential (mitochondrial membrane potential, 螖 蠄 m) were detected by JC-1 immunofluorescence staining. After treated with MMC, the fluorescence results showed that the mitochondrial membrane potential of FLS was decreased. In addition, the results of Western blot showed that 50mg/L MMC treatment could increase the expression of Bax protein, decrease the expression of Bcl-2 protein, and promote the activation of Caspase-9,Caspase-3 and PARP (P0.05) in a time-dependent manner. The content of cytochrome C released from mitochondria inward cytoplasm was further determined. The results showed that cytochrome C content in cytoplasm was significantly increased after treatment with MMC, and the difference was statistically significant compared with the control group (P0.05). Conclusion in vitro, mitomycin C can inhibit the proliferation of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis. In a time-and dose-dependent manner, mitomycin C could induce apoptosis of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis, and mitomycin C might induce apoptosis of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis through mitochondrial pathway.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R593.22

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本文編號(hào)：2203470