【摘要】：目的:通過建立穩(wěn)定的C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎模型(Experimental autoimmune thyroiditis,EAT),給予間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)治療EAT,闡明MSCs對(duì)EAT的治療效果與作用,為MSCs的臨床應(yīng)用和自身免疫甲狀腺炎(Autoimmune thyroiditis,AIT)的治療與預(yù)防研究提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.建立小鼠EAT模型。分別在第1天與第14天,對(duì)雌性C57BL/6小鼠給予豬甲狀腺球蛋白和完全弗氏佐劑混合溶液和豬甲狀腺球蛋白與不完全弗氏佐劑混合溶液,建立EAT小鼠模型。并通過甲狀腺組織病理學(xué)檢測、脾臟指數(shù)及相關(guān)甲狀腺自身抗體的表達(dá),判斷模型建立效果。2.MSCs治療EAT模型小鼠。從一周齡小鼠骨實(shí)質(zhì)中分離培養(yǎng)MSCs,倒置光學(xué)顯微鏡,觀察細(xì)胞形態(tài),并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測分離培養(yǎng)獲得的MSCs細(xì)胞表型。EAT模型建立成功后,分別在第0天、第14天尾靜脈移植MSCs,并通過比較移植后各組小鼠甲狀腺的HE染色結(jié)果,脾臟指數(shù)改變情況,血清甲狀腺自身抗體TPOAb、TgAb、TMAb含量,以及流式細(xì)胞術(shù)檢測EAT模型組和MSCs治療組脾細(xì)胞免疫功能的改變,判斷MSCs對(duì)EAT小鼠的治療效果。3.MSCs治療EAT的作用機(jī)制研究。免疫組織化學(xué)法和免疫熒光法檢測EAT小鼠甲狀腺組織的凋亡病變情況。Q-PCR檢測正常對(duì)照組、EAT模型組、MSCs治療組和MSCs中凋亡因子的表達(dá)情況。通過對(duì)治療組小鼠輸注熒光示蹤劑CM-Dil標(biāo)記的MSCs,病理組織切片法結(jié)合免疫熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測MSCs的歸巢能力。體外鑒定MSCs防護(hù)EAT小鼠甲狀腺組織凋亡的作用機(jī)制。結(jié)果:1.采用多點(diǎn)多部位皮下注射豬甲狀腺球蛋白和兩種弗氏佐劑,成功建立小鼠EAT模型。2.分離培養(yǎng)MSCs,倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞成長梭形,成纖維細(xì)胞樣,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明MSCs均高表達(dá)干細(xì)胞表面相關(guān)標(biāo)記。MSCs治療EAT小鼠后,病理組織學(xué)HE染色結(jié)果表明,MSCs治療組小鼠與模型組小鼠的甲狀腺組織均可見不同程度甲狀腺濾泡的破壞及淋巴細(xì)胞的浸潤,但治療組小鼠,病變程度均較輕,無明顯濾泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)性破壞。3組小鼠脾臟指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ELISA法檢測結(jié)果表明,MSCs治療組甲狀腺微粒體抗體、甲狀腺過氧化物酶抗體、甲狀腺球蛋白抗體表達(dá)水平均顯著低于EAT模型小鼠。流式細(xì)胞術(shù)檢測EAT模型小鼠和MSCs治療組小鼠脾臟細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞的表達(dá)情況,結(jié)果表明,MSCs治療后,相較于EAT模型組,小鼠脾臟細(xì)胞CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比例發(fā)生改變。4.免疫組化及免疫熒光染色結(jié)果表明,EAT模型組小鼠的甲狀腺組織細(xì)胞發(fā)生凋亡,MSCs治療組小鼠甲狀腺組織內(nèi)的Fas凋亡通路下游Caspase3的蛋白表達(dá)水平顯著低于EAT模型組,Q-PCR檢測結(jié)果表明,EAT模型組內(nèi)表達(dá)大量的FasL。而MSCs和正常對(duì)照組小鼠甲狀腺組織高表達(dá)凋亡受體Fas。熒光示蹤結(jié)果顯示MSCs可有效歸巢至炎性發(fā)生的甲狀腺組織。體外共培養(yǎng)結(jié)果證實(shí),EAT模型小鼠脾淋巴細(xì)胞能夠作用于正常小鼠甲狀腺組織,誘導(dǎo)凋亡因子Caspase3、Caspase6和Bcl-2高表達(dá),引發(fā)細(xì)胞凋亡,而MSCs可有效阻止EAT模型小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)正常小鼠甲狀腺組織的促凋亡作用。結(jié)論:MSCs能夠有效歸巢到炎癥發(fā)生的甲狀腺組織,通過表達(dá)Fas受體,阻止EAT模型小鼠的CD8+淋巴細(xì)胞對(duì)甲狀腺組織進(jìn)行的殺傷作用與誘導(dǎo)凋亡作用,進(jìn)而對(duì)甲狀腺組織細(xì)胞進(jìn)行保護(hù),抑制自身免疫紊亂引起的甲狀腺損傷,從而延緩實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎的疾病進(jìn)展。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of MSCs on EAT in mice . The expression of CD4 + T cells and CD8 + T cells in the spleen cells of mice with EAT model was significantly lower than that in EAT model group .
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R581.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2133710