本文選題：氯氣 + 急性肺損傷��； 參考：《第四軍醫(yī)大學》2017年碩士論文

【摘要】：背景:氯氣屬于窒息性毒劑,是一種首先在戰(zhàn)爭中使用的化學武器。在第一次世界大戰(zhàn)的伊普雷戰(zhàn)役中,德軍首次在現(xiàn)代戰(zhàn)爭中使用氯氣作為化學戰(zhàn)劑,造成15 000英法聯(lián)軍中毒,約5000人死亡。氯氣還可作為化工原料,廣泛用于造紙、紡織等工業(yè)生產(chǎn)中,現(xiàn)在常用于殺蟲劑、漂白劑、氯堿工業(yè)、溶劑、消毒劑、顏料、塑料、合成纖維的制造等,也在醫(yī)院、游泳池、自來水消毒以及制藥業(yè)、皮革業(yè)、造紙業(yè)、印染工業(yè)等方面被廣泛應用。氯氣中毒事故頻發(fā),中毒人數(shù)眾多,可導致呼吸道刺激癥狀,急性肺損傷(acute lung ingury,ALI),肺水腫,急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome,ARDS)甚至窒息死亡。氯氣中毒主要以吸氧、抗炎等對癥支持治療為主,缺乏特效防治藥物與有效救治措施[1,2]。氯氣暴露后,通過呼吸道侵入機體并溶解在肺泡上皮內(nèi)襯液(epithelial lung lining fluid,ELF)中,引起呼吸道黏膜損傷,病情嚴重時,容易引發(fā)肺水腫,導致心血管循環(huán)功能障礙甚至導致死亡。內(nèi)皮細胞(endothelial cell,EC)作為組織與血液間的第一道屏障,直接感受血管內(nèi)環(huán)境的改變,并能做出相應的反應;氯氣損傷可引發(fā)缺氧,EC通過黃嘌呤氧化酶途徑產(chǎn)生大量自由基,引起EC氧化損傷;同時由于自由基的攻擊,EC清除自由基的能力減弱,加重損傷;自由基很可能是氯氣引起EC通透性升高的信號傳遞物質(zhì)。此外,氯氣中毒可誘導多形核白細胞(polymorphonuclear leukocytes,PMN)和巨噬細胞等炎癥細胞在肺泡毛細血管內(nèi)膜等部位聚集,釋放活性氧(reactive oxygen species,ROS)和多種炎癥介質(zhì),引起肺泡毛細血管通透性增加,形成間質(zhì)或肺泡水腫。本課題將在明確氯氣損傷主要機制的基礎上,從抗氧化、改善循環(huán)的角度切入,驗證中毒機制的同時,為氯氣中毒特效防治藥物研究與有效救治措施制訂理論依據(jù)和提供研究思路。方法:1.氯氣致大鼠急性肺損傷的時間效應關(guān)系研究給予大鼠400 ppm氯氣,染毒5 min,分別在染毒后0h、0.5 h、1.5 h、3 h、6 h、9 h處死動物,取血清、肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和剩余肺組織,采用光鏡與透射電鏡觀察中毒大鼠肺損傷的病理表現(xiàn),生化比色方法測定氯氣損傷后肺通透性與氧化損傷的時間效應關(guān)系,Western blot法測定肺組織中血管損傷相關(guān)蛋白表達水平,探討氯氣致大鼠肺損傷效應并選取損傷干預觀察時間點。2.紅景天苷或己酮可可堿(pentoxifylline,PTX)對氯氣致急性肺損傷的保護作用24只SD大鼠隨機分為4組,分別設為陰性對照組、氯氣暴露組、紅景天苷干預組及單純紅景天苷對照組(或PTX干預組及單純PTX對照組),在染毒前15 min和染毒后30 min給予300 mg/kg紅景天苷或100 mg/kg PTX灌胃,在大鼠染毒后3 h分別取血清、BALF和剩余肺組織,生化比色方法測定肺通透指數(shù)、LDH等肺通透性變化相關(guān)指標以及ROS、MDA、SOD、GSH、GSSG等氧化損傷相關(guān)指標的變化,并檢測肺組織中Na+K+ATPase和Ca2+Mg2+ATPase活性,Western blot法檢測抗氧化酶SOD1、SOD2、CAT的蛋白表達水平,缺氧相關(guān)蛋白HIF-1α、VEGF、occludin、E-Cadherin的表達水平,自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1、PINK1、Parkin蛋白的表達水平;分離提取肺線粒體蛋白和細胞質(zhì)蛋白分別檢測PINK1和Parkin的表達水平。觀察紅景天苷或PTX對氯氣致大鼠急性肺損傷的干預作用,并比較兩種藥物的干預效果。3.PTX在內(nèi)皮細胞線粒體損傷中的保護機制研究利用t-BHP建立氧化損傷的細胞模型,給予PTX進行干預處理,MTT法觀察t-BHP對HUVECs作用的時間和劑量效應關(guān)系,篩選t-BHP的作用時間和半數(shù)致死濃度(LC50)。Mito Tracker Green、Mito SOX和Rho123熒光染色觀察t-BHP對細胞線粒體的影響。隨后觀察了1、2、5和10μg/m L PTX干預對細胞活力的保護作用,光鏡下觀察PTX對細胞形態(tài)的保護作用。生化比色法測定LDH活力和MDA、GSH、GSSG、SOD等氧化損傷相關(guān)指標以及ATP、ATPase等線粒體損傷相關(guān)指標的變化;Clark氧電極測定耗氧量的變化;Western blot法檢測SOD1、SOD2、CAT等氧化損傷相關(guān)蛋白、PINK1、HIF-1α等缺氧相關(guān)蛋白表達水平。觀察PTX干預作用分子機制的同時,評價PTX在氯氣致ALI中的防治效果。結(jié)果:1.400 ppm×5 min氯氣暴露條件下,氯氣暴露后3 h,大鼠肺體積顯著增大,肺血管內(nèi)皮線粒體脊斷裂,呈空泡樣變性,氯氣暴露后0.5 h-3 h,肺組織炎細胞浸潤,肺組織間隙水腫液滲出,肺泡融合斷裂,肺通透性升高,出現(xiàn)明顯肺損傷。表明肺損傷模型復制成功。在氯氣暴露后1.5 h-3 h,大鼠肺組織、支氣管肺泡灌洗液及血清中呈現(xiàn)氧化應激現(xiàn)象,表明在肺水腫形成前大鼠體內(nèi)發(fā)生了一定程度的氧化損傷。隨暴露后時間的延長,緊密連接蛋白E-cadherin與occludin的異常表達與肺損傷程度呈一定的相關(guān)性,氯氣引起的肺損傷中肺血管通透性的增加與緊密連接蛋白的異常表達有關(guān)。2.給予紅景天苷或PTX干預可顯著降低大鼠因氯氣暴露引起的肺通透性升高;藥物干預后,通過降低MDA、GSSG含量、肺組織蛋白SOD1、SOD2和CAT的表達量,升高GSH/GSSG比值,減輕氧化損傷;顯著降低缺氧相關(guān)蛋白HIF-1α、VEGF、occludin的表達,上調(diào)E-caherin蛋白表達水平,下調(diào)ATP依賴性Na+K+ATPase和Ca2+Mg2+ATPase活性;此外,藥物干預后,自噬相關(guān)蛋白LC3 II/LC I比值、Beclin1的表達水平上調(diào),下調(diào)肺組織PINK1、Parkin、線粒體PINK1蛋白表達水平,升高線粒體蛋白Parkin表達水平。比較兩種藥物使用效果,PTX在藥物使用劑量與拮抗范圍方面優(yōu)于紅景天苷。3.采用105μmol/L t-BHP共孵育6 h成功制作氧化應激細胞模型。熒光染色結(jié)果顯示線粒體ROS水平上升,線粒體膜電位和線粒體數(shù)量下降。Clark氧電極檢測結(jié)果顯示耗氧量下降,生化比色法結(jié)果顯示ATP和ATPase活力明顯下降;Western blot法測定Parkin、HIF-1α、VEGF表達水平顯著升高,分離細胞線粒體和胞質(zhì)蛋白,觀察到t-BHP引起PINK1在線粒體上表達量上調(diào),細胞質(zhì)中表達量下降。1μg/m L PTX即可提高細胞活力,下調(diào)Parkin、HIF-1α、VEGF的表達,升高耗氧量、ATP水平和ATPase活力,減輕細胞缺氧程度和保護線粒體功能。結(jié)論:體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,氯氣暴露后3 h,肺損傷加重,伴隨氧化損傷和缺氧。紅景天苷或PTX可能通過降低氧化應激水平,改善缺氧,影響自噬水平,有效改善氯氣中毒引起的ALI。通過比較紅景天苷和PTX的干預效果,發(fā)現(xiàn)PTX藥效優(yōu)于紅景天苷。體外實驗結(jié)果顯示,PTX干預可降低氧化損傷,改善缺氧,保護線粒體,減輕ALI。PTX可能的保護作用機制為:(1)通過清除ROS,減輕氧化損傷、下調(diào)線粒體PINK1轉(zhuǎn)位水平,保護線粒體功能,同時上調(diào)ATP水平、ATPase活力,改善細胞內(nèi)外離子紊亂,減輕肺水腫;(2)改善缺氧,下調(diào)HIF-1α、VEGF蛋白表達水平,減輕緊密連接蛋白損傷,保護肺血管內(nèi)皮通透性,對氯氣損傷發(fā)揮有效作用。本研究在明確氯氣中毒的氧化損傷機制的同時,為氯氣中毒急救藥物的篩選提供基礎實驗數(shù)據(jù),為突發(fā)性氯氣意外泄漏或恐怖活動的應急醫(yī)學處置提供理論依據(jù)。
[Abstract]:BACKGROUND : Chlorine gas is a kind of asphyxiant toxic agent , it is a chemical weapon that first used in war . During the War of First World War , the German military used chlorine as chemical warfare agent for the first time in modern war , which caused 15,000 people to death . Chlorine gas can also be used as chemical raw material . It can cause respiratory irritation symptoms , acute lung injury ( ALI ) , pulmonary edema , acute respiratory distress syndrome ( ARDS ) and printing and dyeing industry . In addition , the effect of chlorine poisoning can induce hypoxia and EC to generate a large number of free radicals through xanthine oxidase pathway , which can cause EC oxidative damage . The changes of expression of Na + K + ATPase and Ca 2 + Mg 2 + ATPase in lung tissues were investigated . The effects of 1 , 2 , 5 and 10 渭g / m L PTX on cell mitochondria were observed . The effects of PTX on the expression of protein SOD1 , SOD2 and CAT in lung tissues were observed . The results showed that PTX could decrease oxidative stress level , decrease oxygen consumption , decrease the level of ATP and decrease the number of mitochondria . The results showed that PTX could reduce oxidative stress , decrease oxygen consumption , protect mitochondria and reduce the level of mitochondrial membrane potential and mitochondria . In order to protect the permeability of pulmonary vascular endothelial cells and play an effective role in the injury of chlorine gas , this study provides basic experimental data for the screening of first - aid drugs for chlorine poisoning , and provides theoretical basis for emergency medical treatment of accidental leakage of chlorine gas or terrorist activities .
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R595.1

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