本文選題：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 + 移植　； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：第一部分 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記目的:通過體外分離、培養(yǎng)、擴增、誘導(dǎo)BMSCs,研究BMSCs的生物學(xué)特性和形態(tài)學(xué)特征。用熒光標(biāo)記BMSCs,通過描繪、對比其生長曲線來比較熒光染料對BMSCs細(xì)胞活性的影響。方法:1.無菌條件下取大鼠的股骨和脛骨,用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、純化BMSCs。待細(xì)胞鋪滿瓶底90%左右,1:2進(jìn)行傳代。2.用流式細(xì)胞儀檢測貼壁細(xì)胞表面抗原,鑒定是否為目的細(xì)胞。3.選取生長狀態(tài)良好的P3代細(xì)胞,成骨誘導(dǎo)21天,行茜素紅和von Kossa改良染色法,觀察其產(chǎn)生鈣結(jié)節(jié)能力。4.用CM-Dil標(biāo)記BMSCs,觀察其標(biāo)記能力。通過計數(shù)和對比非標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目,并繪制生長曲線,明確CM-Dil對BMSCs增殖能力影響。結(jié)果:1.SD大鼠骨髓細(xì)胞全貼壁培養(yǎng)24h后部分貼壁,呈大小不能的球形;48h后大部分細(xì)胞貼壁,呈紡錘形或星形;6-7d后可以進(jìn)行首次傳代。2.所培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞99%以上表達(dá)CD29,CD44和CD90,不表達(dá)CD34,CD45。證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。3.茜素紅染色可見礦化結(jié)節(jié)呈紅色,Von Kossa改良染色法光鏡下可見被染成紅色的細(xì)胞團(tuán)塊中間有粗大的黑色結(jié)節(jié)。證明間充質(zhì)干細(xì)胞確實被誘導(dǎo)成了成骨細(xì)胞并且有鈣結(jié)節(jié)產(chǎn)生。4.CM-Dil對BMSCs的即時標(biāo)記率為100%,通過觀察、計數(shù)、對比其細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞數(shù)目,發(fā)現(xiàn)并無明顯差別。結(jié)論:1.全骨髓貼壁培養(yǎng)法能獲得理想的BMSCs。2.BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后有產(chǎn)生鈣結(jié)節(jié)的能力。3.CM-Dil能夠有效的標(biāo)記BMSCs,且不會影響其生物學(xué)性質(zhì),是體外示蹤的有效方法。第二部分 大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立目的:有效建立大鼠椎體骨質(zhì)疏松模型并鑒定是否骨質(zhì)疏松。方法:1.雌性大鼠雙側(cè)卵巢切除術(shù)。2.通過觀察大鼠陰道分泌物涂片,確認(rèn)是否切除卵巢成功。結(jié)果:切除卵巢的大鼠不再有性動周期,連續(xù)一周的陰道分泌物涂片均停留在動情間期。結(jié)論:1.通過去除大鼠雙側(cè)卵巢建立骨質(zhì)疏松模型的方法是可行的。2.通過連續(xù)觀察大鼠陰道分泌物涂片能夠判斷大鼠去勢成功。第三部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合雙膦酸鹽治療骨質(zhì)疏松椎體的實驗研究目的:在前期建立椎體骨質(zhì)疏松模型基礎(chǔ)上,給予大鼠相應(yīng)椎體移植不同濃度BMSCs以及雙膦酸鹽治療,通過測量相關(guān)指標(biāo),判斷其療效。方法:1.12周齡未交配過的雌性大鼠100只,隨機分為5組,每組20只。①對照組;②去勢組;③去勢+移植組;④去勢+雙膦酸鹽組;⑤去勢+移植+雙膦酸鹽組。2.采用切除雙側(cè)卵巢的方法構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型。去勢12周后,將CM-Dil標(biāo)記的 P3代BMSCs,用 1ml 注射器以5×104/ml、5×105/ml、5×106/ml、5×107/ml、5×108/ml濃度的細(xì)胞懸液等體積分別注入③組和⑤組大鼠L2-L6的椎體,L1椎體注入等體積的熒光懸液。④組和⑤組大鼠給予阿侖膦酸鈉灌胃處理(8.2mg/kg),每周一次,連續(xù)12周。所有大鼠均在同一條件下喂養(yǎng)。3.治療后12w分別處死相應(yīng)組大鼠20只。4.通過硬組織磨片機制作骨磨片,熒光顯微鏡觀察干細(xì)胞是否移植成功。5.通過MicroCT測量相關(guān)的骨代謝指標(biāo),判斷是否有療效。結(jié)果:1.移植干細(xì)胞后12w制作骨組織磨片,熒光顯微鏡下觀察,能觀察到新生骨小梁中有紅色熒光發(fā)出。2.將切除雙側(cè)卵巢的大鼠于12w后分別通過Micro-CT檢測,發(fā)現(xiàn)②組大鼠相比于①組大鼠其椎體BMD,Tb.N,Tb.Th,BV/TV是顯著下降的。BMD降低了37.86%(P0.05);Tb.N 降低了 77.25%(P0.05);Tb.Th 降低了 43.48%(P0.05);BV/TV 降低了 66.67%(P0.05)。3.Micro-CT檢測發(fā)現(xiàn),④組和②組相比,ALE治療能明顯改善大鼠椎體松質(zhì)骨的骨微結(jié)構(gòu),BMD升高了 16.19%(P0.05);Tb.N升高了 49.61%(P0.05);Tb.Th 升高了 57.69%(P0.05);BV/TV 升高了 55.56%(P0.05)。4.Micro-CT檢測發(fā)現(xiàn),③組大鼠L1與②組大鼠椎體骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)相差不大。隨著BMSCs移植濃度的升高,L2-L6椎體呈現(xiàn)出BV/TV,Tb.Th,Tb.N,BMD逐漸增加,BS/BV,Tb.Sp逐漸降低的趨勢。。5.Micro-CT檢測發(fā)現(xiàn),⑤組和③組相比,L2-L6椎體骨密度均升高,L1椎體骨密度與④組骨密度接近,⑤組和①組相比,L6椎體骨密度接近,但前者依然低于后者。結(jié)論:1.熒光標(biāo)記的干細(xì)胞椎體移植成功。2.通過摘除大鼠雙側(cè)卵巢可成功建立骨質(zhì)疏松模型,隨著時間延長,去勢大鼠的骨質(zhì)愈加疏松。3.阿侖膦酸鈉能夠減緩骨質(zhì)疏松的進(jìn)展。4.干細(xì)胞能夠改善骨量,增加骨密度,但是12w內(nèi)并不能增加到正常椎體水平。隨著移植干細(xì)胞數(shù)量的增加,椎體骨密度是增加的,并沒有實驗出最佳的移植濃度。5.阿侖膦酸鈉聯(lián)合干細(xì)胞移植改善骨質(zhì)疏松的效果優(yōu)于單獨運用干細(xì)胞移植和單獨運用阿侖膦酸鈉的效果,但是依然達(dá)不到正常骨質(zhì)水平。
[Abstract]:In vitro isolation , culture , identification and labeling of bone marrow mesenchymal stem cells in rats were studied . The results were as follows : 1 . After 12 weeks of treatment , 100 rats with different concentrations of bone marrow mesenchymal stem cells were injected into 3 groups and 5 脳 105 / ml , 5 脳 106 / ml , 5 脳 107 / ml , 5 脳 108 / ml . Conclusion : 1 . The bone mineral density of L2 - L6 vertebral body is increased with the increase of bone mineral density .
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R580

【參考文獻(xiàn)】

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1 馬力;劉大軍;李德天;劉沛田;邊小慧;;不同分離方法及培養(yǎng)條件對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長增殖及生物學(xué)特性的影響[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2008年38期

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本文編號：2105883