發(fā)布時間：2018-06-28 12:15

  本文選題：雌激素 + 骨質(zhì)疏松��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2017年碩士論文

【摘要】：背景:骨質(zhì)疏松癥是最常見的代謝性骨病,其特征是骨結(jié)構改變,包括骨量減少和骨微結(jié)構破壞。眾所周知,雌激素是維持正常骨量的重要保護因子,絕經(jīng)后婦女雌激素水平降低導致骨質(zhì)流失,引起骨質(zhì)疏松(osteoporosis,OP)及骨折風險增大。女性絕經(jīng)后腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量明顯增加,它能夠抑制骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)向成骨細胞分化,從而抑制骨形成,但TNF-α抑制骨形成的確切機制尚未完全闡釋�，F(xiàn)知,嘌呤系統(tǒng)P2受體能夠調(diào)節(jié)細胞生長,細胞遷移,并參與調(diào)節(jié)多種組織細胞分化,且能夠調(diào)節(jié)骨代謝。但目前尚不清楚,P2受體是否參與了TNF-α抑制骨形成的過程。目的:1.明確在TNF-α抑制MSCs向成骨分化過程中P2受體表達量的改變;2.確定P2受體在TNF-α抑制MSCs的成骨分化中的作用;方法:1、體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞,采用TNF-α(10 ng/ml)干預,成骨誘導第7天后qRT-PCR檢測嘌呤受體家族不同受體及亞型的表達;2.采用去卵巢手術構建絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型,將30只C57小鼠隨機分為三組:10只行去卵巢手術(去卵巢手術組,即OVX組),10只行去卵巢手術加尾靜脈注射TNF-α中和抗體(去卵巢+TNF-α中和抗體組,即OVX+anti-TNF-α組),10只行假手術(假手術組,即Sham組)。利用Micro-CT、四環(huán)素雙標、石蠟包埋切片、硬組織切片、HE染色、免疫組化等方法評價骨超微結(jié)構及骨代謝相關基因的變化;3.ELISA測定各組小鼠血液中TNF-α水平;4.實時熒光定量PCR、Western blot測定目的蛋白水平;堿性磷酸酶活性測定、堿性磷酸酶染色、茜素紅染色評價成骨能力。5.通過CRISPR/Cas9敲除質(zhì)粒及CRISPR激活質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,分別觀察P2Y2受體抑制/過表達時對TNF-α抑制MSCs成骨分化的影響。結(jié)果:1.體外分離骨髓間充質(zhì)干細胞,在成骨誘導培養(yǎng)基中給予10 ng/ml的TNF-α并培養(yǎng),7天后P2Y2受體表達顯著上調(diào)。2.三組小鼠飼養(yǎng)8周后,分離股骨行Micro-CT掃描結(jié)果,顯示去卵巢小鼠BV/TV、Tb.Th、Tb.N值均低于假手術組和去卵巢+TNF-α中和抗體組,且差異均有統(tǒng)計學意義。OVX+TNF-α中和抗體組小鼠骨小梁結(jié)構明顯改善。ELISA測定小鼠血清TNF-α水平,顯示去卵巢組小鼠TNF-α水平顯著高于假手術組和去卵巢+TNF-α中和抗體組。免疫組織化學分析表明:去卵巢+TNF-α中和抗體組小鼠骨組織中P2Y2受體表達水平顯著低于去卵巢組小鼠。獲取三組小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng),qRT-PCR及western blot結(jié)果提示:P2Y2受體在去卵巢+TNF-α中和抗體組中表達水平顯著低于去卵巢組。3.在培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞中,與對照組相比,P2Y2 CRISPR/Cas9敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后成骨特異性相關基因Runx2、Osterix和Osteocalcin表達水平顯著上調(diào),堿性磷酸酶活性顯著增強,且鈣結(jié)節(jié)沉積數(shù)量顯著增加;相反,P2Y2 CRISPR過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Runx2、Osterix和Osteocalcin基因表達顯著下調(diào),堿性磷酸酶活性顯著降低,鈣結(jié)節(jié)沉積數(shù)量顯著減少。TNF-α干預骨髓間充質(zhì)干細胞可顯著下調(diào)Runx2、Osterix和Osteocalcin基因表達、降低堿性磷酸酶活性、且明顯減少鈣結(jié)節(jié)沉積數(shù)量。給予P2Y2 CRISPR/Cas9敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,TNF-α對上述成骨相關指標的抑制作用均被顯著逆轉(zhuǎn)。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的血清中TNF-α表達水平顯著上調(diào),且骨組織中P2Y2受體表達增加,給予TNF-α抗體干預后可顯著逆轉(zhuǎn)去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松嚴重程度,且同時伴隨P2Y2受體表達下調(diào),說明在去卵巢引起骨質(zhì)疏松癥中,P2Y2受體可能參與TNF-α對成骨的抑制作用。體外骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),TNF-α可顯著上調(diào)P2Y2受體表達,并下調(diào)成骨相關基因的表達,而P2Y2基因敲除后可顯著逆轉(zhuǎn)TNF-α對成骨相關基因的抑制作用,進一步證明P2Y2受體參與TNF-α的成骨抑制作用。這些結(jié)果提示,在雌激素水平下降引起的骨質(zhì)疏松癥中,可能是通過上調(diào)P2Y2受體,進一步強化TNF-α對成骨作用的抑制來完成的。
[Abstract]:BACKGROUND : Osteoporosis is the most common metabolic bone disease . It is characterized by changes of bone structure , including osteopenia and destruction of bone microstructure . It is well known that estrogen is an important protective factor to maintain normal bone mass . The results showed that the expression of P2Y2 receptor in bone marrow mesenchymal stem cells was significantly lower than that in sham - operated group and ovariectomized + TNF - 偽 . In vitro bone marrow mesenchymal stem cell culture showed that the expression of P2Y2 receptor could significantly increase the expression of the P2Y2 receptor and down - regulate the expression of TNF - 偽 . These results suggest that the P2Y2 receptor is involved in the formation of bone - related genes . These results suggest that the P2Y2 receptor may be involved in the inhibition of bone formation by up - regulating the P2Y2 receptor .
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R580

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 Teruhito Yamashita;Naoyuki Takahashi;Nobuyuki Udagawa;;New roles of osteoblasts involved in osteoclast differentiation[J];World Journal of Orthopedics;2012年11期

2 趙凡桂;王文君;;雌激素受體的變化與骨質(zhì)疏松研究進展[J];國外醫(yī)學.婦產(chǎn)科學分冊;2006年04期

3 彭幼玲,陳黨生,吳文;絕經(jīng)婦女雌激素補充療法治療骨質(zhì)疏松癥的研究[J];實用婦產(chǎn)科雜志;2002年05期

4 劉石平;;絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥防治中的雌激素替代治療[J];國外醫(yī)學(老年醫(yī)學分冊);2000年04期

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本文編號：2077963