本文選題：細胞自噬 + 糖皮質(zhì)激素　； 參考：《中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2015年碩士論文

【摘要】：目的通過從細胞自噬角度探討糖皮質(zhì)激素對成骨細胞的調(diào)控,即糖皮質(zhì)激素是否引起成骨細胞自噬,自噬流的強弱是否與糖皮質(zhì)激素劑量及作用時間有關(guān),以及人為干預(yù)自噬是否對當(dāng)皮質(zhì)激素作用下的成骨細胞功能產(chǎn)生影響,進一步拓展了激素相關(guān)骨質(zhì)疏松的病理機制,對闡明自噬是否參與了糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松(GIOP),以及為發(fā)現(xiàn)抗骨質(zhì)流失藥物新靶點提供了重要參考價值。方法首先將培養(yǎng)的小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1等量接種于六孔板中,待培養(yǎng)一段時間后,分別加入含有不同濃度地塞米松的培養(yǎng)基(10-8M,10-6M,10-4M),分別在1d,2d,3d,4d時間點收集細胞。①通過Western blot技術(shù)檢測成骨細胞內(nèi)源性自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin1的表達量,探討地塞米松是否誘導(dǎo)了細胞自噬以及自噬水平是否與激素劑量和作用時間有關(guān)。②使用能表達綠色熒光蛋白GFP的LC3B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,然后再與含有不同濃度地塞米松的培養(yǎng)液共同作用,通過熒光共聚焦顯微鏡檢測細胞質(zhì)內(nèi)是否有特征性的GFP-LC3B聚集,即直視下觀察是否有自噬小體的形成以及自噬小體陽性細胞的數(shù)量。③應(yīng)用流式細胞儀檢測地塞米松作用下成骨細胞的凋亡情況,以及人工干預(yù)自噬是否可以調(diào)控成骨細胞凋亡。④最后,應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測地塞米松作用下,功能基因的表達情況,以及加入自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-MA后,成骨細胞功能基因表達是否發(fā)生變化。結(jié)果1.蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測顯示地塞米松誘導(dǎo)下,MC3T3-E1細胞中有LC3-Ⅱ、Beclinl蛋白的表達；熒光共聚焦顯微鏡顯示細胞質(zhì)內(nèi)有GFP-LC3B斑點產(chǎn)生。2.隨著培養(yǎng)液中地塞米松濃度的升高,Western blot檢測成骨細胞內(nèi)源性自噬相關(guān)蛋白LC3B及Beclinl表達均呈上升趨勢。熒光共聚焦顯微鏡檢測eGFP-LC3B標(biāo)記的自噬小體。培養(yǎng)液中藥物濃度上升時,eGFP-LC3B斑點數(shù)量上升、更加濃聚,eGFP-LC3B陽性細胞數(shù)量增多。3.隨著Dex作用時間延長,細胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B及Beclinl的表達在48小時達到峰值,隨后下降。鏡下觀察eGFP-LC3B陽性細胞數(shù)量以及熒光斑點形成情況也與Western blot檢測蛋白表達情況相符。4.隨著地塞米松濃度升高,MC3T3-E1細胞凋亡率增加；加入自噬抑制劑3.MA后,細胞凋亡率上升。5.隨著地塞米松濃度升高,MC3T3-E1細胞Alp、Colla、Ocn基因的表達量下降。加入自噬抑制劑3-MA后,基因表達量進一步降低,加入自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素后,基因表達量下降不明顯。結(jié)論：1.糖皮質(zhì)激素GCs可以誘導(dǎo)小鼠成骨細胞系MC3T3-E1的自噬發(fā)生2.細胞中自噬水平與地塞米松作用濃度呈正相關(guān)；自噬水平在地塞米松作用48h達到峰值,而后隨著時間延長而下降3.地塞米松誘導(dǎo)小鼠成骨細胞的凋亡,且濃度增加凋亡率增高。抑制自噬可以促進細胞的凋亡。4.地塞米松抑制小鼠成骨細胞基因的表達,抑制作用隨濃度增加而增加。提高自噬可以保持基因的表達不受影響,抑制自噬可以進一步抑制基因的表達。
[Abstract]:Objective To investigate the effect of glucocorticoid on osteoblast in vitro by means of Western blot . ( 2 ) The expression of endogenous autophagy - related protein LC3 and Beclin1 was detected by Western blot .
3 . The number of eGFP - LC3B - positive cells increased and the expression of eGFP - LC3B - positive cells increased . The number of eGFP - LC3B - positive cells and the formation of fluorescent spots increased with the increase of dexamethasone concentration .
The apoptosis rate of MC3T3 - E1 cells decreased with the increase of dexamethasone concentration . After addition of autophagy inhibitor 3 - MA , the expression of MC3T3 - E1 cells decreased further , and the expression level of MC3T3 - E1 decreased . Conclusion : 1 . Glucocorticotropin - GCs can induce autophagy of MC3T3 - E1 in mouse osteoblasts .
The autophagy inhibited the apoptosis of osteoblasts in mice after 48 hours of dexamethasone , and then decreased with time .
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R580

【共引文獻】

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1 王琳;Dickkopf-1在動脈粥樣硬化中的作用及其相關(guān)機制的研究[D];山東大學(xué);2014年

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3 仲興;PKC途徑對激素誘導(dǎo)成骨細胞凋亡作用影響的初步研究[D];遼寧醫(yī)學(xué)院;2013年

4 馬喜喜;外周血Dickkopf 1和β-catenin水平在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病活動性和骨與關(guān)節(jié)損傷中的臨床意義[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2014年

5 李寧博;晚期激素性股骨頭壞死股骨頭骨組織中相關(guān)基因表達[D];鄭州大學(xué);2014年

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本文編號：2050550