本文選題：細(xì)胞自噬 + 糖皮質(zhì)激素��； 參考：《中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2015年碩士論文

【摘要】：目的通過從細(xì)胞自噬角度探討糖皮質(zhì)激素對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)控,即糖皮質(zhì)激素是否引起成骨細(xì)胞自噬,自噬流的強(qiáng)弱是否與糖皮質(zhì)激素劑量及作用時(shí)間有關(guān),以及人為干預(yù)自噬是否對(duì)當(dāng)皮質(zhì)激素作用下的成骨細(xì)胞功能產(chǎn)生影響,進(jìn)一步拓展了激素相關(guān)骨質(zhì)疏松的病理機(jī)制,對(duì)闡明自噬是否參與了糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松(GIOP),以及為發(fā)現(xiàn)抗骨質(zhì)流失藥物新靶點(diǎn)提供了重要參考價(jià)值。方法首先將培養(yǎng)的小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1等量接種于六孔板中,待培養(yǎng)一段時(shí)間后,分別加入含有不同濃度地塞米松的培養(yǎng)基(10-8M,10-6M,10-4M),分別在1d,2d,3d,4d時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。①通過Western blot技術(shù)檢測(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)源性自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin1的表達(dá)量,探討地塞米松是否誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬以及自噬水平是否與激素劑量和作用時(shí)間有關(guān)。②使用能表達(dá)綠色熒光蛋白GFP的LC3B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,然后再與含有不同濃度地塞米松的培養(yǎng)液共同作用,通過熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)是否有特征性的GFP-LC3B聚集,即直視下觀察是否有自噬小體的形成以及自噬小體陽性細(xì)胞的數(shù)量。③應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)地塞米松作用下成骨細(xì)胞的凋亡情況,以及人工干預(yù)自噬是否可以調(diào)控成骨細(xì)胞凋亡。④最后,應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)地塞米松作用下,功能基因的表達(dá)情況,以及加入自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-MA后,成骨細(xì)胞功能基因表達(dá)是否發(fā)生變化。結(jié)果1.蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)顯示地塞米松誘導(dǎo)下,MC3T3-E1細(xì)胞中有LC3-Ⅱ、Beclinl蛋白的表達(dá)；熒光共聚焦顯微鏡顯示細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有GFP-LC3B斑點(diǎn)產(chǎn)生。2.隨著培養(yǎng)液中地塞米松濃度的升高,Western blot檢測(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)源性自噬相關(guān)蛋白LC3B及Beclinl表達(dá)均呈上升趨勢(shì)。熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)eGFP-LC3B標(biāo)記的自噬小體。培養(yǎng)液中藥物濃度上升時(shí),eGFP-LC3B斑點(diǎn)數(shù)量上升、更加濃聚,eGFP-LC3B陽性細(xì)胞數(shù)量增多。3.隨著Dex作用時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B及Beclinl的表達(dá)在48小時(shí)達(dá)到峰值,隨后下降。鏡下觀察eGFP-LC3B陽性細(xì)胞數(shù)量以及熒光斑點(diǎn)形成情況也與Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況相符。4.隨著地塞米松濃度升高,MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率增加；加入自噬抑制劑3.MA后,細(xì)胞凋亡率上升。5.隨著地塞米松濃度升高,MC3T3-E1細(xì)胞Alp、Colla、Ocn基因的表達(dá)量下降。加入自噬抑制劑3-MA后,基因表達(dá)量進(jìn)一步降低,加入自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素后,基因表達(dá)量下降不明顯。結(jié)論：1.糖皮質(zhì)激素GCs可以誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1的自噬發(fā)生2.細(xì)胞中自噬水平與地塞米松作用濃度呈正相關(guān)；自噬水平在地塞米松作用48h達(dá)到峰值,而后隨著時(shí)間延長(zhǎng)而下降3.地塞米松誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞的凋亡,且濃度增加凋亡率增高。抑制自噬可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。4.地塞米松抑制小鼠成骨細(xì)胞基因的表達(dá),抑制作用隨濃度增加而增加。提高自噬可以保持基因的表達(dá)不受影響,抑制自噬可以進(jìn)一步抑制基因的表達(dá)。
[Abstract]:Objective To investigate the effect of glucocorticoid on osteoblast in vitro by means of Western blot . ( 2 ) The expression of endogenous autophagy - related protein LC3 and Beclin1 was detected by Western blot .
3 . The number of eGFP - LC3B - positive cells increased and the expression of eGFP - LC3B - positive cells increased . The number of eGFP - LC3B - positive cells and the formation of fluorescent spots increased with the increase of dexamethasone concentration .
The apoptosis rate of MC3T3 - E1 cells decreased with the increase of dexamethasone concentration . After addition of autophagy inhibitor 3 - MA , the expression of MC3T3 - E1 cells decreased further , and the expression level of MC3T3 - E1 decreased . Conclusion : 1 . Glucocorticotropin - GCs can induce autophagy of MC3T3 - E1 in mouse osteoblasts .
The autophagy inhibited the apoptosis of osteoblasts in mice after 48 hours of dexamethasone , and then decreased with time .
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R580

【共引文獻(xiàn)】

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5 李寧博;晚期激素性股骨頭壞死股骨頭骨組織中相關(guān)基因表達(dá)[D];鄭州大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：2050550