本文選題：高糖 + iNOS　； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：血管病變是糖尿病最主要的并發(fā)癥之一。高糖誘發(fā)的炎癥和氧化應(yīng)激導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損,并誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達多種促炎細胞因子,這些細胞因子和氧化應(yīng)激之間形成連鎖反應(yīng),共同促進血管炎癥反應(yīng)。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)是血管壁的重要組成部分,在高血糖和內(nèi)皮細胞釋放的細胞因子作用下發(fā)生炎癥反應(yīng)和功能改變,在糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究表明,鋅指轉(zhuǎn)錄因子Krüppel樣因子5(krüppel-like factor 5,KLF5)在血管重塑中發(fā)揮重要作用。在炎癥因子刺激下,KLF5可通過激活炎癥反應(yīng)信號通路加重炎癥反應(yīng)。在心血管系統(tǒng),血管內(nèi)皮損傷通過誘導(dǎo)KLF5表達而激活參與血管重塑的基因,比如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NO synthase,iNOS)、血小板衍生生長因子-A/B(platelet derived growth factor-A/B,PDGF-A/B)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)以及血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor,VEGF)等。核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)是在多種細胞中存在的多能性轉(zhuǎn)錄因子,可由多種信號(細菌/病毒感染、細胞因子和氧化應(yīng)激等)誘導(dǎo)活化。活化的NF-κB進入細胞核與特定靶基因啟動子結(jié)合并促進其進行轉(zhuǎn)錄,這些表達產(chǎn)物參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。然而,在糖尿病引發(fā)的血管病變中,NF-κB和KLF5之間的相互關(guān)系尚不清楚。在心血管系統(tǒng)中,iNOS主要在VSMC中表達,炎癥反應(yīng)可以上調(diào)iNOS的表達。研究發(fā)現(xiàn),iNOS與人類許多炎癥性疾病有關(guān)。有研究顯示,2型糖尿病患者心血管系統(tǒng)受損程度與iNOS表達呈正相關(guān)。iNOS一旦合成,便催化合成大量的NO,NO與超氧化物(superoxide)相互作用形成過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite,ONOO-),后面通過使蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸硝基化顯示其細胞毒性。研究發(fā)現(xiàn),在糖尿病小鼠的血管中,酪氨酸硝基化水平顯著升高,說明蛋白質(zhì)硝基化參與糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展過程。雖然目前已知糖尿病血管病變與炎癥因子和過氧亞硝基陰離子水平增多有關(guān),但是KLF5、NF-κB和iNOS之間的關(guān)系以及三者在糖尿病血管病變中的相互作用的機制尚不清楚。為了探討上述問題,本研究以糖尿病患者動脈血管組織、STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠模型以及體外培養(yǎng)的VSMC為研究對象,探討在高糖刺激下,iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的ONOO-、KLF5以及NF-κB如何參與VSMC的炎癥反應(yīng),旨在闡明KLF5的硝基化修飾在糖尿病血管炎癥中的作用及分子機制,為研發(fā)抑制血管炎癥反應(yīng)的藥物提供新的靶點。第一部分高糖通過誘導(dǎo)iNOS表達及ONOO-形成促進KLF5表達及硝基化目的:探討高糖誘導(dǎo)iNOS表達及ONOO-形成與KLF5表達及硝基化之間的關(guān)系。方法:1實時定量PCR(qRT-PCR)和Western blot檢測糖尿病患者血管組織中KLF5和iNOS的表達,免疫雙熒光染色檢測KLF5和iNOS在糖尿病患者血管組織中的表達和定位。2用不同濃度葡萄糖(5.5~25 m M)處理VSMC 12 h或高糖(25 m M)處理VSMC不同時間(0~12 h),qRT-PCR和Western blot檢測KLF5和iNOS的表達;給予VSMC高糖(25 m M)處理,免疫熒光染色檢測KLF5和iNOS的定位和表達。3用低糖(5.5 m M)+甘露醇(19.5 m M)或高糖(25 m M)處理VSMC12 h,Western blot檢測KLF5和iNOS的表達;4用si-Ctrl和si-KLF5轉(zhuǎn)染VSMC 24 h后,分別給予低糖(5.5 m M)和高糖(25 m M)處理,Western blot檢測KLF5敲低效率和iNOS的表達。5用低糖(5.5 m M)和高糖(25 m M)處理VSMC,ELISA方法檢測培養(yǎng)基中ONOO-濃度。6用不同濃度SIN-1(0~100μM)處理VSMC 12 h或用100μM SIN-1處理細胞不同時間(0~12 h),qRT-PCR和Western blot檢測KLF5的表達。7用高糖(25 m M)+不同濃度Fe TPPS(0~100μM)處理VSMC,免疫共沉淀檢測KLF5酪氨酸硝基化水平。8分別用低糖(5.5 m M)、高糖(25 m M)、不同濃度SIN-1(0~100μM)、高糖(25 m M)+不同濃度Fe TPPS(0~100μM)、不同濃度SIN-1(0~100μM)+Fe TPPS(0~100μM)處理VSMC,免疫共沉淀和免疫雙熒光染色檢測KLF5酪氨酸硝基化水平。9免疫雙熒光染色方法檢測非糖尿病患者和糖尿病患者動脈血管組織中KLF5酪氨酸硝基化水平。結(jié)果:1糖尿病患者的VSMC中KLF5和iNOS表達升高qRT-PCR結(jié)果顯示,糖尿病患者動脈血管中KLF5和iNOS的表達較非糖尿病患者上升約3倍。Western blot結(jié)果顯示,在蛋白水平上,KLF5和iNOS在糖尿病患者動脈血管中也明顯升高。免疫雙熒光染色結(jié)果顯示,KLF5和iNOS主要在糖尿病患者的VSMC中進行表達。2在體外培養(yǎng)的VSMC中,高糖誘導(dǎo)KLF5和iNOS表達qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,高糖以濃度和時間依賴性的方式誘導(dǎo)KLF5和iNOS表達。在mRNA水平上,KLF5和iNOS水平至少比低糖處理的細胞升高2倍。高糖引起滲透壓的改變對KLF5和iNOS的表達無影響。免疫熒光染色結(jié)果也顯示,高糖能顯著誘導(dǎo)KLF5和iNOS表達。用靶向KLF5的si RNA(si-KLF5)敲低KLF5表達后,再用高糖處理VSMC,Western blot結(jié)果顯示,敲低KLF5后高糖不能再上調(diào)iNOS表達,表明KLF5介導(dǎo)高糖對iNOS表達的誘導(dǎo)作用。ELISA結(jié)果顯示,給予VSMC高糖處理后,細胞培養(yǎng)液中ONOO-濃度明顯升高。3高糖通過誘導(dǎo)iNOS表達和ONOO-形成促進KLF5表達和硝基化qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,在低糖培養(yǎng)的VSMC中,過氧亞硝基供體SIN-1能顯著誘導(dǎo)KLF5表達,呈濃度及時間依賴性。用抗硝基化酪氨酸抗體對細胞裂解液進行免疫沉淀后,用抗KLF5抗體進行Western blot的結(jié)果顯示,過氧亞硝基陰離子分解催化劑Fe TPPS能消除SIN-1誘導(dǎo)的KLF5硝基化,且呈劑量依賴性。免疫共沉淀及免疫雙熒光結(jié)果顯示,高糖或SIN-1均可以誘導(dǎo)KLF5酪氨酸硝基化,Fe TPPS能降低高糖或SIN-1誘導(dǎo)的KLF5酪氨酸硝基化水平。這些結(jié)果表明,KLF5酪氨酸硝基化是由ONOO-引起的。對人動脈血管組織切片進行免疫雙熒光染色的結(jié)果顯示,與非糖尿病患者相比,糖尿病患者動脈血管中KLF5酪氨酸硝基化水平明顯升高。小結(jié):糖尿病患者的VSMC中KLF5和iNOS表達均升高,高糖能顯著誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的VSMC表達KLF5和iNOS。iNOS催化產(chǎn)生的ONOO-促進KLF5表達和硝基化。第二部分iNOS產(chǎn)生的ONOO-通過促進KLF5和NF-κB p50硝基化及兩者相互作用而上調(diào)炎性因子基因表達目的:揭示ONOO-促進炎癥細胞因子表達的分子機制。方法:1用不同濃度葡萄糖(0~25 m M)處理VSMC 12 h或用高糖(25 m M)處理細胞不同時間(0~12 h),Western blot檢測NF-κB p50蛋白表達。2分別用低糖(5.5 m M)、高糖(25 m M)、SIN-1(100μM)、高糖(25 m M)+不同濃度Fe TPPS(0~100μM)處理VSMC,Western blot檢測NF-κB p50表達。3用低糖(5.5 m M)、高糖(25 m M)、SIN-1(100μM)、高糖(25 m M)+不同濃度Fe TPPS(0~100μM)處理VSMC,免疫共沉淀檢測NF-κB p50的酪氨酸硝基化水平、KLF5和NF-κB p50相互作用以及KLF5和NF-κB p50硝基化對其相互作用的影響。免疫雙熒光染色檢測KLF5和NF-κB p50的相互作用。4用低糖(5.5 m M)、高糖(25 m M)、SIN-1(100μM)、高糖(25 m M)+不同濃度Fe TPPS(0~100μM)處理VSMC,qRT-PCR和Western blot檢測炎癥相關(guān)基因的表達。免疫熒光染色檢測炎性因子的定位和表達。5用si-KLF5敲低KLF5表達或用Ad-KLF5過表達KLF5,再分別用低糖(5.5 m M)、高糖(25 m M)和SIN-1(100μM)處理VSMC,qRT-PCR和Western blot檢測炎癥相關(guān)基因的表達。6 qRT-PCR和Western blot檢測糖尿病小鼠主動脈中KLF5、NF-κB p50、iNOS以及炎癥相關(guān)基因的表達。7免疫雙熒光染色檢測糖尿病小鼠主動脈VSMC中KLF5的表達。8免疫共沉淀和免疫雙熒光染色檢測糖尿病小鼠主動脈中KLF5和NF-κB p50的酪氨酸硝基化水平。結(jié)果:1 KLF5和NF-κB p50的酪氨酸硝基化使兩者相互作用增強Western blot結(jié)果顯示,高糖以濃度和時間依賴的方式誘導(dǎo)NF-κB p50表達。此外,SIN-1也顯著誘導(dǎo)NF-κB p50表達,Fe TPPS可消除高糖對NF-κB p50表達的誘導(dǎo)作用,說明ONOO-介導(dǎo)高糖對NF-κB p50表達的誘導(dǎo)。免疫共沉淀結(jié)果顯示,與低糖組相比,高糖或SIN-1使NF-κB p50的酪氨酸硝基化水平增加4-5倍,而Fe TPPS能消除高糖誘導(dǎo)的NF-κB p50酪氨酸硝基化。與低糖組相比,高糖或SIN-1處理VSMC后,KLF5和NF-κB p50之間的相互作用增強。在用KLF5抗體或NF-κB p50抗體免疫共沉淀的沉淀物中,硝基化的NF-κB p50或硝基化的KLF5均顯著升高。與此同時,用Fe TPPS清除ONOO-可以消除高糖誘導(dǎo)的KLF5和NF-κB p50之間的相互作用。這些結(jié)果表明,高糖或SIN-1誘導(dǎo)的KLF5與NF-κB p50之間的相互作用依賴于KLF5和NF-κB p50的酪氨酸硝基化。免疫熒光結(jié)果也顯示,與低糖組相比,高糖或SIN-1處理VSMC后,KLF5和NF-κB p50相互作用增強,高糖+Fe TPPS處理的細胞與單獨用高糖或SIN-1處理的細胞相比,KLF5與NF-κB p50的相互作用顯著減少。2 KLF5與NF-κB p50相互作用促進炎性細胞因子基因表達Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示,用高糖或者SIN-1處理VSMC能顯著上調(diào)IL-1β和TNF-α表達,Fe TPPS可以取消高糖對這兩種炎性因子表達的誘導(dǎo)作用。在mRNA水平上,高糖或SIN-1使IL-1β和TNF-α水平至少升高2.5倍。免疫熒光染色也得到了同樣結(jié)果。用si-KLF5敲低KLF5后,Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示,在si-Ctrl組,高糖能上調(diào)IL-1β和TNF-α表達;但在KLF5敲低組,無論是否給予高糖處理,IL-1β和TNF-α表達均無明顯變化。用Ad-KLF5轉(zhuǎn)染VSMC使KLF5過表達后,在mRNA及蛋白水平上,與Ad-GFP組相比,無論是否給予高糖刺激,IL-1β和TNF-α表達均升高10倍以上。用si-KLF5敲低KLF5后,高糖和/或SIN-1,均不再能上調(diào)IL-1β和TNF-α表達。這些結(jié)果表明,KLF5在高糖誘導(dǎo)炎性細胞因子表達中發(fā)揮必不可少的作用。3在VSMC特異性敲除KLF5(KLF5Δ/Δ)的糖尿病小鼠血管中,炎性細胞因子基因表達明顯降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠與非糖尿病小鼠相比,血糖顯著升高,體重明顯下降。而給予STZ的KLF5Δ/Δ小鼠與非糖尿病小鼠相比,血糖雖有升高,但明顯低于STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠,且體重下降不明顯。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與非糖尿病小鼠相比,STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠主動脈組織中KLF5、NF-κB p50和iNOS的表達均明顯升高;而KLF5Δ/Δ小鼠無論是否給予STZ,KLF5、NF-κB p50和iNOS的表達均降低。免疫雙熒光染色結(jié)果顯示,在小鼠主動脈VSMC中,與非糖尿病小鼠相比,STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠KLF5表達明顯增多,在KLF5Δ/Δ小鼠,無論是否給予STZ,都檢測不到KLF5表達。用qRT-PCR和Western blot檢測小鼠血管組織中炎性基因表達的結(jié)果顯示,STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠與非糖尿病小鼠相比,主動脈中IL-1β和TNF-α表達明顯增加,而KLF5Δ/Δ小鼠無論是否給予STZ,IL-1β和TNF-α表達都沒有明顯變化,給予STZ的KLF5Δ/Δ小鼠與STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠相比,IL-1β和TNF-α表達明顯下降。免疫共沉淀結(jié)果顯示,STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠主動脈中KLF5和NF-κB p50的酪氨酸硝基化水平較非糖尿病小鼠明顯升高。免疫雙熒光染色結(jié)果也顯示,糖尿病小鼠主動脈中KLF5和NF-κB p50的酪氨酸硝基化水平較非糖尿病小鼠明顯升高,而KLF5Δ/Δ小鼠,無論是否給予STZ,KLF5和NF-κB p50的酪氨酸硝基化水平均明顯低于非糖尿病小鼠。小結(jié):在VSMC中,高糖誘導(dǎo)的KLF5和NF-κB p50酪氨酸硝基化促進二者結(jié)合并協(xié)同促進IL-1β和TNF-α基因表達。在VSMC特異性敲除KLF5的糖尿病小鼠血管或敲低KLF5的VSMC中,IL-1β和TNF-α基因表達明顯下降。KLF5在高糖誘導(dǎo)炎性細胞因子表達中發(fā)揮必不可少的作用。第三部分17β-雌二醇通過誘導(dǎo)ERα與NF-κB p50相互作用而阻抑KLF5與NF-κB p50的結(jié)合,進而抑制炎性細胞因子表達目的:探索17β-雌二醇抑制高糖誘導(dǎo)血管炎癥反應(yīng)的分子機制。方法:1用高糖(25 m M)+不同濃度17β-雌二醇(0~100 n M)處理VSMC,qRT-PCR和Western blot檢測KLF5、NF-κB p50、iNOS、IL-1β和TNF-α的表達。2用VSMC高糖(25 m M)、高糖(25 m M)+17β-雌二醇(100 n M)、高糖(25 m M)+17β-雌二醇(100 n M)+雌激素受體α(estrogen receptorα,ERα)阻斷劑(ICI182780)(1μM)處理VSMC,qRT-PCR和Western blot檢測KLF5、NF-κB p50、iNOS、IL-1β和TNF-α的表達,免疫熒光染色檢測上述基因在細胞內(nèi)的定位和表達。3細胞經(jīng)上述處理后,免疫共沉淀及免疫熒光染色方法檢測KLF5與NF-κB p50以及ERα與NF-κB p50的相互作用。結(jié)果:1 17β-雌二醇下調(diào)高糖誘導(dǎo)的KLF5、NF-κB p50、iNOS、IL-1β和TNF-α的表達用VSMC高糖+不同濃度17β-雌二醇(0~100 n M)處理VSMC后,qRT-PCR和Western blot檢測炎癥相關(guān)基因的表達。結(jié)果顯示,與單獨用高糖處理的VSMC相比,高糖+17β-雌二醇處理的細胞中,KLF5、NF-κB p50、iNOS、IL-1β和TNF-α的表達均顯著下調(diào),且呈劑量依賴性。2 17β-雌二醇通過ERα下調(diào)高糖誘導(dǎo)的KLF5、NF-κB p50、iNOS、IL-1β和TNF-α的基因表達用VSMC高糖、高糖+17β-雌二醇、高糖+17β-雌二醇+ICI182780處理VSMC,qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,高糖使KLF5、NF-κB p50、iNOS、IL-1β和TNF-α的表達上調(diào);17β-雌二醇能消除高糖對這些基因表達的誘導(dǎo)作用;用高糖+17β-雌二醇+ICI182780處理細胞后,17β-雌二醇對高糖效應(yīng)的拮抗作用被消除。免疫熒光染色也得到了同樣的結(jié)果。這些結(jié)果表明,ERα介導(dǎo)17β-雌二醇的抗炎作用。3 17β-雌二醇促進ERα與NF-κB p50相互作用,阻抑KLF5與NF-κB p50結(jié)合,進而拮抗KLF5和NF-κB p50的協(xié)同促炎作用免疫共沉淀結(jié)果,在高糖培養(yǎng)的VSMC中,KLF5主要與NF-κB p50結(jié)合,ERα與NF-κB p50的結(jié)合很少。用高糖+17β-雌二醇共同處理VSMC時,與單獨用高糖處理的細胞相比,ERα與NF-κB p50的相互作用顯著增強,而KLF5與NF-κB p50的相互作用明顯減少。用高糖+17β-雌二醇+ICI182780處理細胞后,17β-雌二醇誘導(dǎo)的ERα與NF-κB p50的相互作用被減弱,說明ICI182780抵消了17β-雌二醇對ERα與NF-κB p50相互作用的誘導(dǎo)。免疫雙熒光染色結(jié)果顯示,用高糖+17β-雌二醇處理VSMC后,與單純高糖處理的細胞相比,KLF5與NF-κB p50的共定位明顯減少,而ERα與NF-κB p50的共定位明顯增強。這些結(jié)果表明,被17β-雌二醇激活的ERα可與KLF5競爭性地與NF-κB p50結(jié)合。用高糖聯(lián)合+17β-雌二醇+ICI182780處理細胞后,17β-雌二醇誘導(dǎo)的ERα與NF-κB p50的共定位被減弱。上述結(jié)果說明,17β-雌二醇通過活化ERα而促進其與KLF5相互作用,并進而減少KLF5與NF-κB p50的結(jié)合。小結(jié):ERα介導(dǎo)17β-雌二醇對高糖誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)基因表達的阻抑作用,其作用機制是通過促進ERα與NF-κB p50相互作用,抑制KLF5與NF-κB p50結(jié)合來實現(xiàn)的。結(jié)論:1糖尿病患者的VSMC中KLF5和iNOS表達均顯著升高。2在體外培養(yǎng)的VSMC中,高糖誘導(dǎo)KLF5和iNOS表達。3高糖通過iNOS產(chǎn)生的ONOO-促進KLF5的表達及酪氨酸硝基化。4 KLF5和NF-κB p50的硝基化有利于兩者相互作用并協(xié)同促進IL-1β和TNF-α表達。5 VSMC特異性敲除KLF5的糖尿病小鼠血管中,炎癥相關(guān)基因表達明顯下降。6 17β-雌二醇促進ERα與NF-κB p50相互作用,抑制KLF5與NF-κB p50結(jié)合,進而拮抗KLF5和NF-κB p50的協(xié)同促炎作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 龔邵新;莊英幟;趙強;賀榮芳;丁慧;胡義燕;陽帥;曾慶彪;;KLF4和KLF5蛋白在不同臨床分期胃癌組織中的表達及意義[J];中國癌癥雜志;2010年10期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 張曼莉;高糖誘導(dǎo)的KLF5表達和硝基化在糖尿病血管炎癥反應(yīng)中的作用及機制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2017年

2 李欣;前列腺癌中廢除KLF5的乙酰化修飾將其由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榇侔┗騕D];南開大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張琪;FBXW7、SRC-3和KLF5在胃癌中的表達及臨床意義[D];鄭州大學(xué);2012年

，

本文編號：1986201