本文選題：類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid + arthritis　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：研究背景：類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以對(duì)稱(chēng)性、破壞性的慢性關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要病理變化的自身免疫性疾病。盡管RA發(fā)病機(jī)制尚不明確,但研究表明自身免疫反應(yīng)在RA滑膜炎病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),在RA患者血液、關(guān)節(jié)滑膜(液)和軟骨組織表層存在多種自身抗原、抗瓜氨酸化蛋白自身抗體(anti-cyclic citrullinated peptide antibody,ACPA)及免疫復(fù)合物(immune complex,IC)。目前已發(fā)現(xiàn)多種瓜氨酸化蛋白為ACPA的靶抗原,如波形蛋白(Vim)、纖維蛋白(原)、Ⅱ型膠原、聚絲蛋白、α-烯醇酶和角蛋白等,這些蛋白均以瓜氨酸化形式存在于RA炎性關(guān)節(jié)內(nèi)。IC通過(guò)與補(bǔ)體成分、細(xì)胞Fc受體和補(bǔ)體受體結(jié)合誘導(dǎo)促炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,是RA炎癥反應(yīng)導(dǎo)致關(guān)節(jié)骨和軟骨組織損傷和關(guān)節(jié)畸變的最主要機(jī)制。骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病,因其易累及膝關(guān)節(jié),形成膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA),與RA具有相似的臨床癥狀,故兩者的鑒別診斷十分必要。成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes, FLSs)是構(gòu)成關(guān)節(jié)滑膜組織的主要細(xì)胞成分。RA滑膜炎癥中存在著復(fù)雜的FLS-巨噬細(xì)胞-淋巴細(xì)胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)。目前認(rèn)為,雖然RA患者關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),但真正導(dǎo)致滑膜增生的原因是FLSs的過(guò)度增殖與活化。RA滑膜組織內(nèi)FLSs不僅大量增生,還以自分泌和旁分泌的方式來(lái)分泌或應(yīng)答多種炎性介質(zhì)如細(xì)胞因子(cytokine, CKs)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等效應(yīng)分子,對(duì)單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和骨及軟骨細(xì)胞發(fā)揮多效性作用(pleiotropic effects),參與RA滑膜增生和軟骨及骨質(zhì)破壞過(guò)程。因此,研究滑膜細(xì)胞的功能對(duì)進(jìn)一步探討RA的發(fā)病機(jī)制及體外篩選抗類(lèi)風(fēng)濕藥物具有重要意義。迄今為止,有關(guān)IC對(duì)RA滑膜免疫活性細(xì)胞功能影響的研究?jī)H局限在單核巨噬細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等。然而,有關(guān)IC特別是ACPA特異性IC (ACPA-IC)對(duì)RA患者FLS增殖、分泌炎性介質(zhì)(CKs、MMPs)等功能影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于關(guān)節(jié)滑膜液(synovial fluid,SF)是RA免疫炎性損害的重要靶位,而ACPA、IC和FLSs均為RA重要的效應(yīng)分子和細(xì)胞,對(duì)SF中IC進(jìn)行深入研究,更能直接反映滑膜組織局部IC和FLSs參與滑膜炎性損傷的作用。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)研究,我們提出如下假設(shè),RA患者關(guān)節(jié)滑膜局部炎癥反應(yīng)引起相關(guān)自身抗原的瓜氨酸化,導(dǎo)致ACPA產(chǎn)生,后者與瓜氨酸化蛋白結(jié)合形成ACPA-IC。RA患者關(guān)節(jié)SF中存在含多種瓜氨酸化抗原的ACPA-IC,ACPA-IC與滑膜FLSs結(jié)合,誘導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)基因表達(dá),激活相應(yīng)信號(hào)通路,使信號(hào)分子活性增高,促進(jìn)其下游促炎性CKs和MMPs等炎性介質(zhì)的分泌,這些炎性介質(zhì)又能反過(guò)來(lái)作用于滑膜組織(synovial tissue,ST)中各種免疫活性細(xì)胞,增強(qiáng)局部炎癥反應(yīng),導(dǎo)致更多Cit-P的產(chǎn)生,形成惡性循環(huán),進(jìn)而導(dǎo)致更嚴(yán)重的骨和軟骨破壞。肽酰基精氨酸脫亞氨酶(peptidylarginine deiminase,PADI)是一種翻譯后修飾酶,它能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)內(nèi)的精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸殘基,瓜氨酸化蛋白的形成與ACPA的產(chǎn)生和RA的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。瓜氨酸是一種非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸,它不參與翻譯過(guò)程中的蛋白合成過(guò)程,而是由PADI酶在Ca2+存在條件下翻譯后修飾生成的。有人認(rèn)為瓜氨酸化和精氨酸殘基甲基化是同時(shí)存在的競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程,PADI酶可以通過(guò)將甲基化精氨酸轉(zhuǎn)換成瓜氨酸而逆轉(zhuǎn)氨基酸殘基的甲基化。在哺乳動(dòng)物中,PADI酶家族主要分為五種同工酶,即PADI1、PADI2、PADI3 PADI4和PADI6。而每種PADI酶都有其典型的細(xì)胞定位、組織分布和特異底物。PADI1主要表達(dá)在皮膚組織,它可將絲聚合蛋白和角蛋白瓜氨酸化,有助于皮膚的角化。PADI2是PADI酶中分布最廣的,它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脾臟、分泌腺和骨骼肌組織中均高水平表達(dá),其底物蛋白主要包括大腦和脊髓的髓磷脂堿性蛋白和凋亡單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中的波形蛋白。PADI3僅在毛囊表達(dá),對(duì)毛發(fā)的定向生長(zhǎng)起著重要作用。而PADI4在白細(xì)胞中高表達(dá)。細(xì)胞核中,它主要介導(dǎo)核仁磷酸蛋白和組蛋白的瓜氨酸化。最近發(fā)現(xiàn),PADI6在卵巢和睪丸組織高水平表達(dá),但是它的功能和酶活性尚不明確。其中PADI2和PADI4與RA關(guān)系最為密切。目的：1.取RA和OA患者關(guān)節(jié)液中提取的抗瓜氨酸化肽特異性免疫復(fù)合物(anti-citrullinated peptide antibody specific immune complexes,ACPA-ICs),在不同IC濃度梯度下,分別對(duì)RA患者關(guān)節(jié)FLSs進(jìn)行刺激,以探討ACPA-IC對(duì)FLSs增殖功能的影響。2.取RA和OA患者關(guān)節(jié)液中提取的ACPA-IC,在不同IC濃度梯度下,分別對(duì)RA患者關(guān)節(jié)FLSs進(jìn)行刺激,用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3的含量,以探討ACPA-IC對(duì)FLSs CKs和MMPs分泌功能的影響。3.分別從RA和OA患者關(guān)節(jié)滑膜組織(synovial tissue,ST)提取蛋白,并對(duì)兩組蛋白進(jìn)行鑒定。4.將從RA和OA患者ST中提取的蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè),以分析RA和OA患者ST中PADI4的表達(dá)量是否存在差異。同時(shí),對(duì)RA患者血清抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(抗CCP)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、抗鏈球菌溶血素O(anti-streptolysin,ASO)和RF等相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),以期研究滑膜組織中PADI4的表達(dá)量與臨床相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)是否具有相關(guān)性。進(jìn)一步探討PADI4在RA中的致病作用。方法：1.采用G蛋白免疫親和層析法,從RA患者和OA患者關(guān)節(jié)液中提取IC,BCA法檢測(cè)提取后各組ICs蛋白質(zhì)濃度；CLIA法檢測(cè)提取后及混合前后各組IC中ACPA的濃度。2.無(wú)菌條件下獲取手術(shù)切除的RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織,分離純化FLSs,并進(jìn)行體外培養(yǎng),取第4～7代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)刺激。3.用純化后的各組IC刺激RA FLSs,CCK-8法檢測(cè)刺激后FLSs的增殖情況。4.用ELISA法分析IC刺激RA FLSs后細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3的分泌情況。5.無(wú)菌條件下獲取手術(shù)切除的RA和OA患者的關(guān)節(jié)ST,液氮研磨提取蛋白,western blot法檢測(cè)ST中PADI4蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：1.RA-IC刺激對(duì)RA FLSs增殖的影響與對(duì)照組OA-IC組和空白對(duì)照組(BC)相比,四種濃度(25μg/ml、50μg/ml、 100μg/ml、200μg/ml)的ACPA-IC刺激FLSs 48h后,對(duì)FLSs增殖有一定抑制作用,且在25μg/ml、50μg/ml和100 μ g/ml三個(gè)濃度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),但隨著濃度的升高,抑制作用逐漸減弱；OA-IC和BC組相比,對(duì)FLSs的增殖無(wú)作用。2.關(guān)節(jié)液RA-IC刺激對(duì)RA FLSs分泌CKs功能的影響ACPA-IC刺激FLSs 24-72h后,在細(xì)胞培養(yǎng)上清中可測(cè)到大量IL-6、IL-8、 GM-CSF和MMP-3,其水平顯著高于OA-IC刺激組(P0.05)。其中50μg/ml、 100μg/ml和200 μ g/ml的RA-IC組刺激后,FLSs分泌GM-CSF和IL-6量均顯著高于OA-IC組和BC組。RA-IC刺激FLSs分泌IL-8的作用最強(qiáng),四種刺激濃度,其含量均明顯高于OA-IC組與BC組,且差異顯著(P0.01)。而MMP-3僅在RA-IC刺激濃度為100 μ g/ml和200μ g/ml時(shí),與OA-IC組和BC組存在顯著性差異(P0.01)。提示低濃度時(shí),關(guān)節(jié)液RA-IC對(duì)FLSs刺激MMP-3分泌作用較弱。OA-IC組與BC組間刺激作用差異并不明顯,僅在低濃度時(shí),兩組MMP-3分泌水平存在些許差異。同時(shí),三組中IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3分泌水平均隨著時(shí)間增加而增加,說(shuō)明二者間也存在一定正相關(guān)性。3.滑膜組織提取蛋白鑒定分別取等量RA和OA患者滑膜組織提取蛋白混合,蛋白質(zhì)定量后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示,RA組出現(xiàn)若干OA組中沒(méi)有的條帶,在電泳圖上25KDa和55KDa位置可見(jiàn)兩條深染條帶,分別為抗體Ig的輕鏈和重鏈部分。4.RA、OA患者ST PADI4表達(dá)水平RA患者ST的PADI4的表達(dá)水平明顯高于OA患者(P0.05),但未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平的高低與患者血清中抗CCP、RF、CRP和ASO水平存在相關(guān)關(guān)系。結(jié)論：1.RA患者關(guān)節(jié)液中較高水平的ACPA-IC對(duì)FLSs增殖具有一定抑制作用,隨刺激濃度升高抑制作用逐漸減弱,但低刺激濃度和更高刺激濃度的作用尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。2.RA患者關(guān)節(jié)液IC可刺激FLSs分泌高水平的IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3,提示ACPA-IC中含有的瓜氨酸化蛋白(citrullinated protein,CitP)或ACPA可能在刺激FLSs分泌CKs和MMPs的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。3.SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示,RA組存在若干OA組中沒(méi)有的條帶,其中可能含有瓜氨酸化的蛋白及可與鼠抗PADI4抗體結(jié)合的抗原成分。4.通過(guò)檢測(cè)RA及OA患者ST PADI4的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)RA患者ST的PADI4的表達(dá)水平明顯高于OA患者,但其表達(dá)水平的高低可能與患者血清中抗CCP、 RF、CRP和ASO水平并不存在相關(guān)關(guān)系。
[Abstract]:Background : Rheumatoid arthritis ( RA ) is a kind of autoimmune disease characterized by symmetry and destruction . Although the pathogenesis of RA is not clear , the study shows that autoimmune response plays an important role in the pathological process of RA . In recent years , it has been found that there are a variety of autoantigens , anti - cyclic peptide antibody ( ACPA ) and immune complex ( IC ) in the blood , synovial fluid and cartilage tissue surface of RA patients . In this study , it is necessary to study the function of synoviocytes in RA patients , and it is necessary to study the effects of various inflammatory mediators such as cytokine , CKs and matrix metalloproteinases . PADI is a kind of non - standard amino acid . It is a kind of non - standard amino acid . The effects of ACPA - IC on the proliferation of FLSs were studied by Western blot . The levels of IL - 6 , IL - 8 , GM - CSF and MMP - 3 in RA and OA patients were determined .
The expression of IL - 6 , IL - 8 , GM - CSF and MMP - 3 in patients with RA and OA were detected by ELISA . Results : 1 . The effect of RA - IC stimulation on the proliferation of FLSs was detected by Western blot . Results : 1 . The effect of RA - IC stimulation on the proliferation of FLSs was statistically significant ( P0.01 ) .
The levels of IL - 6 , IL - 8 , GM - CSF and MMP - 3 in RA - IC were significantly higher than those in OA - IC and BC groups . There is no correlation between RF , CRP and ASO levels .
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R593.22

【參考文獻(xiàn)】

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1 高德玉;陳芳芳;劉陽(yáng);王凱;虞偉;嚴(yán)孝嶺;李曉軍;;抗瓜氨酸化肽特異性免疫復(fù)合物對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞功能影響的研究[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2013年02期

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本文編號(hào)：1972058