本文選題：HIV-1 + 人源單克隆抗體��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2015年博士論文

【摘要】：為實(shí)現(xiàn)預(yù)防、治療和治愈艾滋病的目標(biāo),近二十年來基于HIV-1中和抗體的研究成為熱點(diǎn)。這些HIV中和抗體為通過技術(shù)手段在艾滋病感染者血液中分離、鑒定和改造的具有廣譜中和活性的抗體,HIV中和抗體在疫苗設(shè)計(jì)和免疫治療艾滋病感染者中發(fā)揮重要作用。目前為止,中國(guó)已發(fā)現(xiàn)了A、B'、B、C、CRF_D2(CRF07_BC/CRF08_BC)、 CRF01_AE、CRF02_AG7種亞型的HIV病毒,其中HIVB/C、A/E重組亞型毒株已成為中國(guó)主要的流行毒株。本論文以中國(guó)流行株B/C亞型病人為研究對(duì)象,在前期篩選到Y(jié)498Fab抗體的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)該抗體的抗病毒活性和機(jī)制進(jìn)行了研究。在前期大規(guī)模篩選人源單克隆抗體的基礎(chǔ)上,我們首先表達(dá)純化了Y498Fab形式的抗體,通過活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗體Y498Fab具有交叉反應(yīng)活性和中和活性,之后成功構(gòu)建了全分子Y498 (Y498IgG)抗體,進(jìn)行活性檢測(cè),發(fā)現(xiàn)Y498對(duì)HIV-1 B、C、B/C多種亞型抗原具有交叉反應(yīng)活性,同樣對(duì)指示毒株NL4-3和SF162具有中和活性,SPR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Y498抗體與JRFL抗原有著非常強(qiáng)的親和力,KD值為0.86nM,均高于b12(1.11nM)和VRC01 (5.35nM);與CN54抗原同樣有著非常強(qiáng)的親和力,KD值為0.46nM,均高于b12(13.28nM)和VRC01 (25.29nM)。而針對(duì)被檢測(cè)的八個(gè)亞型81株假病毒中,Y498能夠有效中和高達(dá)26%(21/81)的假病毒株,在81株假病毒中,有43株中國(guó)株,Y498能夠中和其中的12株,占28%,而在所有被檢測(cè)的B/C亞型中國(guó)株中,Y498的中和能力達(dá)到32%,且Y498對(duì)部分假病毒株中和能力強(qiáng)于b12和VRC01。提示該抗體具有一定的廣譜中和活性。我們進(jìn)一步對(duì)Y498的抗病毒機(jī)制做了研究。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Y498抗體與b12抗體一樣,識(shí)別HIV-1包膜刺突上gp120的構(gòu)象表位,隨后的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其識(shí)別gp120上的CD4結(jié)合區(qū),并與b12和VRC01競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)Y498抗體所識(shí)別的表位,聯(lián)合篩選噬菌體隨機(jī)展示文庫(kù)技術(shù)發(fā)現(xiàn),兩者共有15個(gè)氨基酸位點(diǎn)重疊,我們以噬菌體12肽隨機(jī)展示文庫(kù)篩選到的6條肽段為基礎(chǔ),利用Pepitope service軟件對(duì)Y498所識(shí)別的表位進(jìn)行預(yù)測(cè),共得到24個(gè)可能的表位氨基酸殘基,對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)一步定點(diǎn)突變進(jìn)行活性檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有4個(gè)重要的氨基酸位點(diǎn)影響了Y498抗體的結(jié)合活性,分別為F277, D279, D368, E370,該4個(gè)位點(diǎn)均位于gp120的CD4結(jié)合區(qū)內(nèi),隨后的針對(duì)突變株中和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),有2個(gè)氨基酸位點(diǎn)影響了該抗體的中和能力,分別為D368,E370,并且它們同時(shí)影響了Y498抗體的結(jié)合活性和中和活性,據(jù)此認(rèn)為D368和E370為Y498抗體識(shí)別表位的關(guān)鍵位點(diǎn)。將這些Y498抗體表位相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)與VRC01和b12相比較,發(fā)現(xiàn)D279為VRC01的關(guān)鍵位點(diǎn),D368和E370為b12的關(guān)鍵位點(diǎn),該結(jié)果與Y498分別競(jìng)爭(zhēng)VRC01和b12相吻合。少數(shù)情況下,突變導(dǎo)致了中和活性的提高,推測(cè)主要由于單個(gè)氨基酸突變不足以破壞高親和力抗體結(jié)合配體,這種情況同時(shí)印證了VRC01的類似中和機(jī)制。結(jié)合CD4在gp120上的結(jié)合位點(diǎn)分布,利用PyMOL軟件將Y498抗體所識(shí)別的表位氨基酸進(jìn)行展示,發(fā)現(xiàn)該四個(gè)位點(diǎn)位于CD4結(jié)合區(qū)的loop D區(qū)(F277, D279), CD4 binding Loop區(qū)(D368,E370)。綜合針對(duì)Y498的抗病毒活性和機(jī)制研究,我們得出結(jié)論：Y498抗體對(duì)HIV-1不同亞型抗原均有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)活性和高的親和力,同時(shí)對(duì)不同亞型的部分病毒毒株具有較為廣譜的中和能力；Y498主要識(shí)別CD4結(jié)合區(qū)的CD4 binding loop,通過阻斷受體結(jié)合的作用機(jī)制來阻止HIV的入侵;表位鑒定發(fā)現(xiàn)F277, D279, D368和E370為該抗體識(shí)別表位的關(guān)鍵氨基酸。Y498抗體的抗病毒活性和機(jī)制研究對(duì)了解HIV感染的中和抗體免疫應(yīng)答分子機(jī)制,艾滋病疫苗設(shè)計(jì)以及免疫治療和預(yù)防等具有一定的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:In order to achieve the goal of prevention , treatment and cure of AIDS , HIV - 1 neutralizing antibodies have become hot spots in recent 20 years . These HIV neutralizing antibodies have played an important role in the isolation , identification and modification of HIV - 1 neutralizing antibodies by technical means . So far , China has found A , B The anti - virus activity and activity of Y498Fab were studied . The results showed that Y498 had a strong affinity to the anti - HIV - 1 B , C and B / C subtypes . Four important amino acid sites were found to be the key sites of Y498 antibody recognition epitopes . The results showed that D368 and E370 were the key sites of antibody recognition .
Y498 mainly recognizes the CD4 binding loop of CD4 binding region , prevents the invasion of HIV by blocking the binding mechanism of the receptor , and finds that F277 , D279 , D368 and E370 are the key amino acids of the epitope of the antibody . The antiviral activity and mechanism of Y498 antibody have certain scientific significance and application value in understanding the mechanism of neutralizing antibody immune response in HIV infection , the design of AIDS vaccine and immunotherapy and prevention .
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.91

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本文編號(hào)：1947330