本文選題：晚期氧化蛋白 + RAGE受體��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種全身性自身免疫病,表現(xiàn)為以雙手和腕關(guān)節(jié)等小關(guān)節(jié)受累為主的慢性、對(duì)稱性、持續(xù)性多關(guān)節(jié)炎。RA的病理表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、繼而出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞,最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。自身免疫性炎癥引起受累關(guān)節(jié)局部炎性因子蓄積,進(jìn)而啟動(dòng)受累關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)、導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織的破壞,是RA發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨組織中唯一存在的細(xì)胞類型。研究表明RA受累關(guān)節(jié)中,炎癥因子誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡是關(guān)節(jié)軟骨破壞的始動(dòng)因素,在RA的發(fā)病過(guò)程中起到了非常重要的作用。因此,深入研究RA發(fā)病過(guò)程中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,有利于進(jìn)一步揭示RA的發(fā)病機(jī)制、開(kāi)拓其防治的新途徑,是保護(hù)我國(guó)有限醫(yī)療資源、關(guān)系到社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要課題。細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)是細(xì)胞在感受到相應(yīng)的信號(hào)刺激后,胞內(nèi)一系列控制開(kāi)關(guān)的開(kāi)啟或關(guān)閉。不同的外界因素啟動(dòng)凋亡的方式不同,所引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也不相同。既往的研究證實(shí):不同的細(xì)胞外凋亡誘發(fā)因子可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞活性氧生成增加、線粒體功能障礙及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的凋亡。但不同的誘因或不同的細(xì)胞系,其調(diào)控途徑并不完全相同。正常機(jī)體代謝會(huì)不斷產(chǎn)生活性氧類物質(zhì)(Reactive oxygen species,ROS),主要包括超氧陰離子(O2-)、羥基自由基(-OH)和過(guò)氧化氫(H2O2)。機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)能將多余的ROS轉(zhuǎn)化為對(duì)機(jī)體無(wú)害的物質(zhì),進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行新陳代謝。過(guò)量的ROS生成會(huì)打破體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)的平衡,導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)的發(fā)生。研究表明氧化應(yīng)激在RA的發(fā)病以及軟骨細(xì)胞的凋亡過(guò)程中起到了十分重要的作用。此外,氧化應(yīng)激易引發(fā)蛋白質(zhì)的氧化損傷,導(dǎo)致體內(nèi)氧化損傷蛋白質(zhì)的蓄積。晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidation protein products,AOPPs)是蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基酸遭受氧化損傷后的交聯(lián)物。既往研究表明,許多氧化應(yīng)激相關(guān)疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、尿毒癥、糖尿病、炎癥性腸病、肥胖癥等患者體內(nèi)的AOPPs水平明顯高于正常人,并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。因此,AOPPs是氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志物。AOPPs不僅是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物,其本身能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生ROS進(jìn)而形成正反饋,使機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)持續(xù)存在。既往研究和本課題組證實(shí)AOPPs作為一種新型的炎癥介質(zhì),本身可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)的生成導(dǎo)致氧化應(yīng)激,在很多慢性炎性疾病的發(fā)展過(guò)程中起到了十分重要的作用。此外,AOPPs具有細(xì)胞毒性作用,可通過(guò)不同的細(xì)胞機(jī)制誘導(dǎo)多種不同類型細(xì)胞的凋亡。RA作為一種慢性炎性疾病,患者體內(nèi)普遍存在AOPPs的蓄積。本課題組的前期研究證實(shí),AOPPs可誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)滑膜樣細(xì)胞產(chǎn)生炎癥應(yīng)答,可能參與RA的發(fā)生發(fā)展。但是迄今為止,AOPPs對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制尚不清楚。因此有理由假設(shè),AOPPs作為一類內(nèi)源性致病介質(zhì),通過(guò)氧化還原相關(guān)的途徑促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。本課題旨在闡明AOPPs對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的作用及其分子機(jī)制,為RA的防治提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。研究方法1、晚期氧化蛋白產(chǎn)物AOPPs的制備大鼠血清白蛋白(Rat serum albumin,RSA),溶于無(wú)內(nèi)毒素的PBS中配制成20mg/ml的溶液。將RSA溶液與40mmol/L的次氯酸鈉等體積混合(摩爾比為1:140),室溫放置30分鐘待其充分反應(yīng)。將制備完成的AOPPs裝入透析袋中,隨后將透析袋放至不含內(nèi)毒素的PBS溶液中4℃透析24h,以去除未反應(yīng)的次氯酸鈉。抽取透析完成的AOPPs溶液,用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌。隨后用Detoxi-Gel內(nèi)毒素去除膠,過(guò)濾除去溶液中的內(nèi)毒素。用鱟試劑檢測(cè)制備完成的AOPPs溶液內(nèi)的內(nèi)毒素水平,內(nèi)毒素水平在0.025EU/ml以下的AOPPs溶液可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將成功制備完成的AOPPs根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求分裝,放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?避免溶液反復(fù)凍融。用Elasia試劑盒檢測(cè)溶液中AOPPs的水平。2、大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)將4只3周齡的SD大鼠頸椎脫臼法處死后,在嚴(yán)格無(wú)菌的條件下,取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)及股骨頭處關(guān)節(jié)軟骨組織。隨后放入盛有含雙抗無(wú)菌PBS溶液的容器中,仔細(xì)清除附著的韌帶及骨組織,并用含雙抗的無(wú)菌PBS溶液反復(fù)沖洗三次以上。將沖洗干凈的關(guān)節(jié)軟骨組織轉(zhuǎn)移入5ml離心管中,加入1ml濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液。使用經(jīng)高壓蒸汽消毒過(guò)的眼科剪將軟骨組織剪成細(xì)小碎塊,再加入3ml濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液至離心管中。將離心管放入恒溫?fù)u箱中,37℃下?lián)u晃消化20分鐘。隨后以2000的轉(zhuǎn)速離心后棄去上清液,再加入4ml濃度為0.2%的Ⅱ型膠原酶溶液,放入恒溫?fù)u箱中,37℃下?lián)u晃消化1h。2000轉(zhuǎn)離心棄去上清液,加入細(xì)胞完全培養(yǎng)基,用一次性巴氏吸管反復(fù)吹吸軟骨組織塊懸液。將含有完全培養(yǎng)基的關(guān)節(jié)軟骨組織塊懸液,均勻地涂抹在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),使得軟骨組織塊均勻分布于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。直立培養(yǎng)瓶,向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入3～4ml完全培養(yǎng)基,翻轉(zhuǎn)放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。24小時(shí)后將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái),使完全培養(yǎng)基完全浸沒(méi)軟骨組織塊,繼續(xù)放在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。3天后顯微鏡下觀察軟骨組織塊生長(zhǎng)情況,并更換完全培養(yǎng)基。以后每隔2天換液一次,待組織塊中原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞爬出。一般3天左右即有細(xì)胞爬出,1周左右時(shí)可傳代培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,將原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞按1:3的比例,接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中(此為第一代細(xì)胞)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化和阿利新藍(lán)染色法對(duì)第一代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)此方法培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞具有很高的純度并且表型維持良好。因此我們?nèi)〉谝淮募?xì)胞,用于后續(xù)一系列實(shí)驗(yàn)。3、AOPPs誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡將關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種于六孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右融合時(shí)加入AOPPs刺激。實(shí)驗(yàn)前更換不含血清的DMEM,饑餓細(xì)胞12小時(shí)。用25、50、100、2000μg/ml濃度的AOPPs,200μg/ml未經(jīng)修飾的RSA以及單純完全培養(yǎng)基作為對(duì)照,刺激細(xì)胞24小時(shí)。用AnnexinV-FITC/PI雙熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)及Cell Death Detection ELISA plus試劑盒,檢測(cè)AOPPs對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的的作用。AnnexinV-FITC/PI原理:早期凋亡的細(xì)胞可被AnnexinV-FITC標(biāo)記顯示綠色熒光,流式細(xì)胞儀凋亡圖中顯示在Q2象限。晚期凋亡的細(xì)胞可被Annexin V-FITC及PI兩種熒光同時(shí)標(biāo)記顯示紅綠兩種熒光,流式細(xì)胞儀凋亡圖中顯示在Q4象限。Cell Death Detection ELISA plus試劑盒原理:試劑盒中含特異性抗體,可與細(xì)胞凋亡時(shí)釋放至細(xì)胞質(zhì)中的組蛋白相關(guān)的DNA碎裂片段結(jié)合。經(jīng)顯色反應(yīng)后用酶標(biāo)儀檢測(cè),用OD值反映其濃度。將2×104個(gè)軟骨細(xì)胞接種于35mm激光共聚焦培養(yǎng)皿中。隨后用200μg/ml的AOPPs、200μg/ml未經(jīng)修飾的RSA以及單純完全培養(yǎng)基作為對(duì)照,刺激細(xì)胞24小時(shí)。AnnexinV-FITC/PI雙熒光標(biāo)記細(xì)胞后,共聚焦顯微鏡下觀察不同組間細(xì)胞凋亡情況。4、AOPPs激活關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶系統(tǒng)及相關(guān)受體途徑將關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種于6cm培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右融合時(shí)加入AOPPs刺激。實(shí)驗(yàn)前更換不含血清的DMEM,饑餓細(xì)胞12小時(shí)。用100μg/ml濃度的AOPPs分別刺激細(xì)胞6、12、24及48小時(shí),100μg/ml未經(jīng)修飾的RSA以及單純完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)作為對(duì)照。用Western blot法檢測(cè)不同處理組間NADPH氧化酶亞基p22phox、p47phox、Nox2及Nox4的表達(dá)情況。用l00μg/ml濃度的AOPPs分別刺激細(xì)胞5、15、30及60分鐘,100μg/ml未經(jīng)修飾的RSA以及單純完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞60分鐘作為對(duì)照。用p22phox及p47phox抗體免疫沉淀各處理組蛋白。檢測(cè)p47phox磷酸化及p22phox與p47phox、Nox2及Nox4的結(jié)合。RAGE受體阻斷劑及CD36受體阻斷劑預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí),重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。觀察不同受體阻斷劑對(duì)AOPPs誘導(dǎo)NADPH各亞基表達(dá),47phox磷酸化及p22phox與其它亞基的結(jié)合情況。5、AOPPs誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS生成、來(lái)源及相關(guān)的受體轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種于96孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右融合時(shí)加入AOPPs刺激。實(shí)驗(yàn)前更換不含血清的DMEM,饑餓細(xì)胞12小時(shí)。用25、50、100、200μg/ml濃度的AOPPs,200μg/ml未經(jīng)修飾的RSA以及單純完全培養(yǎng)基作為對(duì)照,刺激細(xì)胞120分鐘。用熒光探針二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA),檢測(cè)不同處理組間細(xì)胞內(nèi)ROS的水平觀察濃度效應(yīng)。濃度為200μg/ml的AOPPs分別刺激關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞5、10、20、30、40、50、60、90及120分鐘,后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平觀察時(shí)間效應(yīng)。用不同的受體阻斷劑及不同ROS誘導(dǎo)生成酶系統(tǒng)的阻斷劑預(yù)處理細(xì)胞,再加入200μg/ml的AOPPs刺激細(xì)胞60分鐘。觀察哪些阻斷劑可以阻斷AOPPs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,以判斷細(xì)胞內(nèi)ROS的來(lái)源及受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。將2×104個(gè)軟骨細(xì)胞接種于35mm激光共聚焦培養(yǎng)皿中。隨后用2000μg/ml的AOPPs、2000μg/ml未經(jīng)修飾的RSA以及單純完全培養(yǎng)基作為對(duì)照,刺激細(xì)胞60分鐘。DCFH-DA孵育細(xì)胞后,共聚焦顯微鏡下觀察不同組間細(xì)胞內(nèi)ROS生成情況。6、AOPPs激活關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)分子及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種于6cm培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右融合時(shí)加入AOPPs刺激。實(shí)驗(yàn)前更換不含血清的DMEM,饑餓細(xì)胞12小時(shí)。用100μg/ml濃度的AOPPs分別刺激細(xì)胞6、12、24及48小時(shí),100μg/ml未經(jīng)修飾的RSA以及單純完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)作為對(duì)照。用Western blot法檢測(cè)不同處理組間凋亡信號(hào)蛋白的表達(dá)情況。將2×104個(gè)軟骨細(xì)胞接種于35mm激光共聚焦培養(yǎng)皿中。隨后用100μg/ml的AOPPs、100μg/ml未經(jīng)修飾的RSA以及單純完全培養(yǎng)基作為對(duì)照,刺激細(xì)胞24小時(shí)。JC-1熒光探針?lè)跤?xì)胞后,共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞線粒體膜電位變化情況。用不同的受體阻斷劑、ROS誘導(dǎo)生成酶系統(tǒng)的阻斷劑及ROS清除劑預(yù)處理細(xì)胞。再加入l0Oμg/ml的AOPPs刺激細(xì)胞48小時(shí)。用Western blot法檢測(cè)不同處理組間凋亡信號(hào)蛋白的表達(dá)情況,判斷活性氧及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表面受體在凋亡信號(hào)激活中的作用。7、阻斷不同層面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,對(duì)AOPPs誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響。用RAGE及CD36受體阻斷劑、NADPH氧化酶抑制劑(DPI和apocynin)、ROS清除劑(catalase和SOD)、Caspase抑制劑(Z-VAD-FMK)預(yù)處理關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。再加AOPPs刺激,用AnnexinV-FITC/PI雙熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞凋亡ELISA試劑盒,檢測(cè)不同層面信號(hào)阻斷劑對(duì)AOPPs誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的的影響。8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)所攝圖片為鏡下隨機(jī)獲得,CCK8實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次,其余所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。每個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)取這些數(shù)據(jù)的平均值,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0完成。多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA方法,在做兩兩比較時(shí)先計(jì)算方差齊性,當(dāng)方差齊時(shí)兩兩比較采用LSD法,方差不齊時(shí)兩兩比較采用DunnettsT3法;多個(gè)樣本非參數(shù)比較采取多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)(K Independent Samples Test),當(dāng)p0.05時(shí)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、AOPPs能誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)示:單純完全培養(yǎng)基、2000μg/ml未經(jīng)修飾的RSA及25、50、100、200μg/ml濃度AOPPs組,關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡率分別為5.4%、4.6%、7.5%、8.2%、9.1%及15.4%。與對(duì)照組相比隨著AOPPs濃度的增加,關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡率逐漸升高。激光共聚焦顯微鏡下觀察可見(jiàn):與對(duì)照組相比,鏡下綠色熒光標(biāo)記陽(yáng)性(代表早期凋亡)與紅綠色雙熒光標(biāo)記陽(yáng)性(代表晚期凋亡)的細(xì)胞明顯增加。預(yù)先加入NADPH氧化酶抑制劑apocynin,可減少AOPPs組凋亡細(xì)胞的數(shù)量。ELISA結(jié)果顯示:單純完全培養(yǎng)基、200μg/ml未經(jīng)修飾的RSA及25、50、100、2000μg/ml濃度AOPPs組,關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞質(zhì)中組蛋白相關(guān)的DNA碎裂片段值分別為0.51、0.49、0.65、0.74、0.72及0.71。與對(duì)照組相比AOPPs處理組細(xì)胞質(zhì)中組蛋白相關(guān)的DNA碎裂片段明顯增多,50μg/ml濃度AOPPs處理組數(shù)值最高。單純完全培養(yǎng)基、50μg/ml未經(jīng)修飾的RSA及50μg/ml濃度AOPPs刺激12、24、48小時(shí)組的組蛋白相關(guān)的DNA碎裂片段值分別為0.52、0.49、0.75、0.84及0.94,隨刺激時(shí)間增加,含量逐漸升高。2、AOPPs通過(guò)RAGE而非CD36受體途徑,激活關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶系統(tǒng)與對(duì)照組相比,AOPPs刺激后p47phox磷酸化水平、p22phox與p47phox、Nox2及Nox4復(fù)合物含量在5分鐘時(shí)即開(kāi)始增高。說(shuō)明AOPPs能快速激活關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶系統(tǒng)。此外與對(duì)照組相比,AOPPs刺激后Western blot結(jié)果顯示:NADPH氧化酶各亞基包括p22phox、p47phox、Nox2及Nox4蛋白表達(dá)上調(diào),為NADPH氧化酶的持續(xù)激活提供了條件。封閉RAGE和CD36重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:RAGE受體信號(hào)阻斷劑(可溶性封閉型RAGE抗體及不含細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)的可溶性RAGE多肽)能抑制AOPPs對(duì)細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶系統(tǒng)的激活及NADPH氧化酶各亞基蛋白表達(dá)的上調(diào),而CD36受體信號(hào)阻斷劑(可溶性封閉型CD36抗體)不具備此效應(yīng)。說(shuō)明AOPPs對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶系統(tǒng)的激活,主要由RAGE而非CD36受體介導(dǎo)。3、AOPPs通過(guò)RAGE受體途徑,誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶依賴的ROS生成與對(duì)照組相比AOPPs刺激后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平在5分鐘時(shí)即開(kāi)始增高,并且隨著時(shí)間的推移其含量不斷增高,呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴效應(yīng)。共聚焦顯微鏡下觀察,進(jìn)一步證明AOPPs可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平增高。此外用NADPH氧化酶抑制劑apocynin預(yù)處理細(xì)胞,可極大的降低AOPPs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS生成。為進(jìn)一步闡明細(xì)胞內(nèi)ROS的來(lái)源,用不同ROS誘導(dǎo)生成酶系統(tǒng)的阻斷劑預(yù)處理細(xì)胞。結(jié)果顯示ROS清除劑(SOD和catalase)、NADPH氧化酶抑制劑(apocynin和DPI)可極大的降低AOPPs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS生成;而線粒體呼吸鏈抑制劑(retenone和TIFA)及一氧化氮合酶抑制劑L-NAME不具備此效應(yīng)。最后為證實(shí)AOPPs誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS生成的受體信號(hào)來(lái)源,AOPPs刺激前用可溶性封閉型RAGE抗體、可溶性RAGE多肽及可溶性封閉型CD36抗體預(yù)處理細(xì)胞。結(jié)果顯示:阻斷RAGE受體能較大程度的阻斷AOPPs誘導(dǎo)的ROS生成,而阻斷CD36受體不具備此效應(yīng)。說(shuō)明AOPPs誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS生成的信號(hào),由RAGE受體轉(zhuǎn)導(dǎo)。4、AOPPs刺激觸發(fā)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)源性凋亡通路的激活內(nèi)源性凋亡通路主要由線粒體功能障礙及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)。在AOPPs的刺激下Western blot結(jié)果顯示:線粒體凋亡通路中的促凋亡分子Bax、Cytochrome C表達(dá)上調(diào),而抗凋亡分子Bcl-2表達(dá)下調(diào);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路中的促凋亡分子Chop及Cleaved caspase-12表達(dá)上調(diào);它們下游共同的促凋亡分子Cleaved caspase-9及Cleaved caspase-3水平上調(diào),而具備受損DNA修復(fù)功能的抗凋亡分子PARP水平下調(diào)。激光共聚焦顯微鏡下觀察:AOPPs刺激可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位水平的下降。預(yù)先孵育NADPH氧化酶抑制劑apocynin,可較大程度的逆轉(zhuǎn)AOPPs所致的線粒體膜電位水平下降。上述實(shí)驗(yàn)證明AOPPs可激活,由線粒體功能障礙及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路。5、AOPPs對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)源性凋亡通路的激活由RAGE受體及NADPH來(lái)源的ROS介導(dǎo)為闡明AOPPs觸發(fā)的內(nèi)源性凋亡通路的受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在AOPPs刺激前用可溶性封閉型RAGE抗體、可溶性RAGE多肽及可溶性封閉型CD36抗體預(yù)處理細(xì)胞。Western blot結(jié)果顯示:封閉RAGE受體可逆轉(zhuǎn)AOPPs誘導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路中促凋亡分子Bax、Cytochrome C、Chop、Cleaved caspase-12、Cleaved caspase-9及Cleaved caspase-3水平的上調(diào);同時(shí)可逆轉(zhuǎn)AOPPs誘導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路中抗凋亡分子Bcl-2和PARP的下調(diào);而封閉CD36受體不具備此效應(yīng)。說(shuō)明AOPPs觸發(fā)的內(nèi)源性凋亡通路激活,受RAGE受體調(diào)控。為闡明NADPH來(lái)源的ROS,是否為AOPPs觸發(fā)的內(nèi)源性凋亡通路的上游信號(hào)分子。在AOPPs刺激前,預(yù)先加入ROS清除劑(SOD和catalase)及NADPH氧化酶抑制劑(apocynin 和 DPI)。Western blot 結(jié)果顯示:預(yù)先加入 SOD、catalase、apocynin和DPI,可較大程度的抑制AOPPs對(duì)內(nèi)源性凋亡通路的激活。說(shuō)明NADPH來(lái)源的ROS,為AOPPs激活的內(nèi)源性凋亡通路中的上游信號(hào)分子。6、RAGE受體封閉、抑制NADPH氧化酶、清除細(xì)胞內(nèi)ROS及抑制Caspase可逆轉(zhuǎn)AOPPs誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡為驗(yàn)證阻斷不同層面的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),對(duì)AOPPs誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡作用的影響。在AOPPs刺激前用可溶性封閉型RAGE抗體、可溶性RAGE多肽、可溶性封閉型CD36抗體、NADPH氧化酶抑制劑apocynin、ROS清除劑SOD和Caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理細(xì)胞。AnnexinV-FITC/PI雙熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)及Cell Death Detection ELISA結(jié)果顯示:封閉RAGE受體、抑制NADPH氧化酶、清除細(xì)胞內(nèi)ROS及抑制Caspase,可逆轉(zhuǎn)AOPPs誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡及胞質(zhì)中組蛋白相關(guān)的DNA碎裂片段的升高;而封閉CD36受體不具備此效應(yīng)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)在體外證明了:AOPPs可激活關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)源性凋亡通路,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;NADPH來(lái)源的ROS是該效應(yīng)重要的上游信號(hào)分子;該效應(yīng)一系列信號(hào)通路的激活由RAGE受體轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象提示:在RA患者體內(nèi)蓄積的新型致炎因子AOPPs。可通過(guò)RAGE受體,激活NADPH氧化酶,觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS生成,通過(guò)氧化還原敏感的內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡,進(jìn)而參與了 RA的發(fā)生發(fā)展。針對(duì)AOPPs病理生物學(xué)效應(yīng)的阻斷方式,可能為防治RA提供新的治療思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R593.22

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本文編號(hào)：1903198