本文關(guān)鍵詞：糖尿病性骨質(zhì)疏松發(fā)病規(guī)律及Runx2、Osterix在骨形成中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《山東大學(xué)》 2015年

IL-17F對(duì)Wistar大鼠成骨細(xì)胞增殖、ALP活性和Runx2、Osterix mRNA表達(dá)影響

趙旭  

【摘要】：目的在不同時(shí)間點(diǎn)采用不同濃度的IL-17F干預(yù)大鼠原代成骨細(xì)胞,觀察對(duì)大鼠原代成骨細(xì)胞的增殖能力和ALP活性的影響,以及對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix mRNA的表達(dá)的影響。探討IL-17F對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖和分化功能的作用,觀察成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix以及Runx2 mRNA在IL-17F干預(yù)下表達(dá)的變化,探尋炎癥因子IL-17F在骨形成中的作用,以期為臨床治療骨質(zhì)疏松和相關(guān)骨代謝疾病提供理論依據(jù)。方法1.細(xì)胞提取、培養(yǎng)和鑒定：取出生24小時(shí)以內(nèi)Wistar大鼠8只,雌雄不限,采用拉頸法處死,在無菌條件下取其顱骨,分別采用胰酶-膠原酶消化法和組織塊反復(fù)貼壁法提取原代成骨細(xì)胞,37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),待細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底面積80%左右時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代,并采用差異貼壁法純化成骨細(xì)胞。采用第4代成骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。成骨細(xì)胞的鑒定：(1)采用倒置相差顯微鏡觀察成骨細(xì)胞形態(tài)和生長情況,定期拍照記錄。(2)采用堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)染色法(鈣鈷法)鑒定成骨細(xì)胞。2.實(shí)驗(yàn)分組及處理：將第3代成骨細(xì)胞,胰酶消化、離心后制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/ml,加入到6孔板中培養(yǎng)24小時(shí)。待細(xì)胞貼壁后換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí),使細(xì)胞同步化。將6孔板內(nèi)細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組采用含10%胎牛血清(Fatal bovine serum, FBS)低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),前期預(yù)實(shí)驗(yàn)分別用Ing/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml和100ng/ml的IL-17F干預(yù)成骨細(xì)胞,結(jié)果顯示濃度為20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的IL-17F對(duì)成骨細(xì)胞的作用明顯,因此實(shí)驗(yàn)組分別應(yīng)用含有20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、IL-17F的10% FBS低糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。分別在IL-17F干預(yù)后的第1、3天留取細(xì)胞上清液待測(cè),-80℃保存,成骨細(xì)胞進(jìn)行以下檢測(cè)。3.指標(biāo)檢測(cè)(1)采用CCK-8法檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖。(2)采用微量酶標(biāo)法檢測(cè)成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALP活性。(3)采用RT-PCR法檢測(cè)成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果1.成骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定：胰酶-膠原酶消化法和組織塊反復(fù)貼壁法均可獲取大鼠成骨細(xì)胞,其細(xì)胞形態(tài)特征和生長情況符合成骨細(xì)胞特點(diǎn)。通過倒置相差顯微鏡觀察ALP染色結(jié)果,發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞內(nèi)的ALP反應(yīng)生成不溶性染料,呈現(xiàn)黑色顆�；驁F(tuán)塊,證明所培養(yǎng)細(xì)胞為成骨細(xì)胞。2.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖：與對(duì)照組相比,第1天細(xì)胞增殖率實(shí)驗(yàn)組50ng/ml組和100ng/ml組均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),20ng/ml組也有升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第3天實(shí)驗(yàn)組20ng/ml、50ng/ml組和100ng/ml組均高于對(duì)照組(P0.05)；第5天的實(shí)驗(yàn)組20ng/ml組、50ng/ml組和100ng/ml組細(xì)胞增殖率增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與實(shí)驗(yàn)組20ng/ml組相比,實(shí)驗(yàn)組100ng/ml組在第1、3、5天細(xì)胞增值率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；第3天50ng/ml組和100ng/ml組均高于21ng/ml組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與實(shí)驗(yàn)組50ng/ml組相比,100ng/ml組在1、3和5天均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.微量酶標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞上清液ALP活性與對(duì)照組相比,第1天實(shí)驗(yàn)組20ng/ml和50ng/ml組ALP活性降低,100ng/ml組ALP活性增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；第3天實(shí)驗(yàn)組20ng/ml和50ng/ml組ALP活性較對(duì)照組降低,而100ng/ml組ALP活性與對(duì)照組、20ng/ml組和50ng/ml組相比均增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4. Runx2和Osterix mRNA表達(dá)變化與對(duì)照組相比,1、3、5天50 ng/ml組和100ng/ml組Runx2mRNA表達(dá)增高(P0.05)：與實(shí)驗(yàn)組20ng/ml組相比,第1、3天100ng/ml組Runx2 mRNA表達(dá)均增加(P0.05),第5天50ng/ml組和100ng/ml組Runx2mRNA表達(dá)均升高(P0.05)；與50 ng/ml組相比,實(shí)驗(yàn)組1、3、5天100ng/ml組Runx2mRNA表達(dá)均增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組第1、3和5天的50ng/ml組和100ng/ml組Osterix mRNA表達(dá)均明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；第1、3、5天50ng/ml組和100ng/ml組Osterix mRNA表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)組20ng/ml組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組100ng/ml組Osterix mRNA表達(dá)均高于50ng/ml組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論IL-17F在20ng/ml～100ng/ml濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖活性,提高ALP活性,這種促進(jìn)作用很可能與IL-17F上調(diào)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix及Runx2mRNA表達(dá)有關(guān),濃度為100ng/ml的IL-17F促進(jìn)作用尤為顯著。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R580
【目錄】：

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【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：187450