本文選題：系統(tǒng)性紅斑狼瘡 + DNA甲基化��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一種常見的累及多系統(tǒng)、多器官的自身免疫性疾病。以DNA甲基化異常為核心的表觀遺傳學(xué)異常是SLE發(fā)病的主要因素。研究發(fā)現(xiàn),SLE患者T細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)基因表達(dá)及酶活性下調(diào),CD70等基因的啟動子去甲基化導(dǎo)致相關(guān)基因過度表達(dá)。ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性抑制因子可抑制T細(xì)胞DNMT1基因表達(dá)及酶活性,從而引起與狼瘡T細(xì)胞類似的免疫紊亂,而該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路缺陷正好也在狼瘡T細(xì)胞中存在。此外,細(xì)胞因子分泌和復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異常是SLE免疫紊亂發(fā)生和各系統(tǒng)、器官的慢性炎癥及器官損害的直接原因。Th17細(xì)胞(T helper cell 17,輔助性T細(xì)胞17)通過其主要效應(yīng)分子白介素(interleukin, IL)-17對SLE靶器官炎癥反應(yīng)的增強作用,進而促進了靶器官的炎性損傷和SLE的發(fā)生發(fā)展。特別是SLE腎損害患者中,Th17細(xì)胞異常活化并且過度分泌IL-17起著重要作用。但是,SLE腎損害Th17細(xì)胞異常活化和分泌IL-17的確切機制還不完全清楚。近來的研究發(fā)現(xiàn),骨橋蛋白(Osteopontin, OPN)作為Th17細(xì)胞異�；罨脱仔砸蜃臃置诘闹匾{(diào)控器,在SLE疾病發(fā)生和靶器官炎性損傷中,特別是SLE腎損害中起著重要作用。第1部分ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在SLE患者表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機制研究背景以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學(xué)特征異常是SLE發(fā)病的重要因素。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)SLE患者T細(xì)胞DNMT1基因表達(dá)減少和酶活性下降,CD70、IL-6等基因啟動子甲基化程度降低,并導(dǎo)致該基因過度表達(dá)。SLE患者T細(xì)胞中ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路缺陷可能在SLE表觀遺傳學(xué)特征異常中起關(guān)鍵作用。最近文獻報道,特異性ERK信號通路抑制劑可以抑制正常T細(xì)胞的DNMT1基因表達(dá)及酶活性并進而出現(xiàn)類似狼瘡T細(xì)胞的免疫異常,而ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性降低正好也在狼瘡T細(xì)胞中存在。故推測SLE患者T細(xì)胞中ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路缺陷可能在SLE表觀遺傳學(xué)特征異常中起關(guān)鍵作用。因此,我們擬利用流式、酶聯(lián)免疫、蛋白印跡、實時熒光定量PCR等技術(shù)研究體內(nèi)狼瘡T細(xì)胞中ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和表觀遺傳學(xué)特征異常的內(nèi)在聯(lián)系,用特異性ERK信號通路抑制劑、DNMT抑制劑處理T細(xì)胞研究體外ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對狼瘡T細(xì)胞表觀遺傳學(xué)特征的影響,從而進一步完善SLE發(fā)病機制中表觀遺傳學(xué)理論,為治療SLE提供新思路和新靶點。研究目的通過研究紅斑狼瘡患者體內(nèi)ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與T淋巴細(xì)胞表觀遺傳學(xué)異常的內(nèi)在聯(lián)系以及體外ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對正常人T淋巴細(xì)胞表觀遺傳學(xué)特征的影響,探討ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機制中的作用,進一步完善SLE發(fā)病機制中表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機制理論,為研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機制的影響提供新的思路,填補國內(nèi)外研究的空白,也為系統(tǒng)性紅斑狼瘡這一自身免疫性疾病的治療提供新策略和新靶點。研究方法1.依據(jù)1997年修訂的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn),分別收集10例SLE患者作為實驗組和10例臨床資料匹配的健康體檢者作為對照組；2.收集實驗組和對照組外周血,先用Ficoll密度梯度離心法分離出單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用免疫磁珠(Immunomagnetic beads,IMB)分離技術(shù)分選CD4+T細(xì)胞,采用流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry,, FCM)檢測分選的CD4+T細(xì)胞百分比；3.實驗組和對照組分選出的CD4+T細(xì)胞,分別用Trizol一步法和RIPA裂解液提取總RNA、DN、.蛋白質(zhì),儲存?zhèn)溆茫?.設(shè)計人ERK1、DNMT1和CD70PCR引物,將提取的總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄RCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)擴增,分析基因mRNA表達(dá)水平；5. 以5甲基胞嘧啶作為DNA甲基化的生物標(biāo)志物,利用印跡法DNA甲基化定量試劑盒(sigma, MDQ1, Amecica)檢測提取DNA的甲基化水平；6.用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測ERK1、DNMT1和CD70蛋白水平；7.采用IMB技術(shù)分離的人CD4+T細(xì)胞,分為ERK抑制組、DNNT抑制組、SLE和正常對照組共4組,分別加入特異性ERK抑制劑(U0126)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(氮雜胞苷)共培養(yǎng)72小時,而正常對照組未經(jīng)任何處理。后續(xù)實驗內(nèi)容同前4、5和6。結(jié)果1.狼瘡T細(xì)胞中存在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下調(diào)和DNA低甲基化。SLE患者外周血T細(xì)胞的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因1表達(dá)顯著低于健康對照組；2.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血T細(xì)胞過度表達(dá)甲基化調(diào)控基因CD70。我們用Western Blot、RT-PCR等方法發(fā)現(xiàn), SLE患者CD70表達(dá)水平較正常人顯著增加；3.DNA甲基化可以調(diào)控多種甲基化敏感基因表達(dá)。特異性DNA甲基化抑制劑氮雜胞苷與人外周血CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)可導(dǎo)致新合成的DNA甲基化水平明顯下降,DNA甲基化敏感基因CD70表達(dá)上調(diào)；4.狼瘡T細(xì)胞基因表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制異常與ERK1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。選擇性有絲分裂原活化蛋白/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶抑制劑U0126抑制正常T細(xì)胞ERK途徑,減少T細(xì)胞DNMT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平,誘導(dǎo)DNA低甲基化,進而調(diào)控甲基化敏感基因CD70表達(dá)。結(jié)論以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機制在SLE疾病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用第2部分ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MRL/lpr鼠表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機制中的作用探討研究背景以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學(xué)特征異常是SLE發(fā)病的重要因素。我們的研究發(fā)現(xiàn)SLE患者T細(xì)胞DNMT1基因表達(dá)減少和酶活性下降,CD70、IL-6等基因啟動子甲基化程度降低,并導(dǎo)致該基因過度表達(dá)。最近文獻報道,特異性ERK信號通路抑制劑可以抑制正常T細(xì)胞的DNMT1基因表達(dá)及酶活性并進而出現(xiàn)類似狼瘡T細(xì)胞的免疫異常,而ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性降低正好也在狼瘡T細(xì)胞中存在。故推測SLE患者T細(xì)胞中ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路缺陷可能在SLE表觀遺傳學(xué)特征異常中起關(guān)鍵作用。因此,我們擬利用流式、酶聯(lián)免疫、蛋白印跡、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等技術(shù)研究MRL/1pr鼠T細(xì)胞中ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和表觀遺傳學(xué)特征異常的內(nèi)在聯(lián)系,用特異性ERK信號通路抑制劑、DNMT抑制劑處理T細(xì)胞研究體外ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對MRL/1pr鼠T細(xì)胞表觀遺傳學(xué)特征的影響,從而進一步完善SLE發(fā)病機制中表觀遺傳學(xué)理論,為治療SLE提供新思路和新靶點。研究目的通過研究MRL/1pr鼠體內(nèi)ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與T淋巴細(xì)胞表觀遺傳學(xué)異常的內(nèi)在聯(lián)系以及體外ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對T淋巴細(xì)胞表觀遺傳學(xué)特征的影響,探討ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機制中的關(guān)鍵作用,進一步完善SLE發(fā)病機制中表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機制理論,為研究ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機制的影響提供新的思路。研究方法1.分別將10只MRL/lpr鼠和10只健康BALB/c小鼠作為動物實驗的實驗組和對照組；2.收集實驗組和對照組脾臟單個核細(xì)胞,用免疫磁珠分離技術(shù)分選鼠CD4+T細(xì)胞,采用流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測所分選的CD4+T細(xì)胞百分比；3.采集鼠實驗組和對照組外周血,先用Ficoll密度梯度離心法分離出單個核細(xì)胞(PBMC),再用免疫磁珠分離技術(shù)分選鼠CD4+T細(xì)胞,分別提取總RNA、DNA、蛋白質(zhì),儲存?zhèn)溆茫?.設(shè)計小鼠ERK1、DNMT1和CD70引物,將提取的總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄RCR擴增,分析各目的基因mRNA表達(dá)水平；5.以5甲基胞嘧啶作為DNA甲基化的生物標(biāo)志物,利用印跡法DNA甲基化定量試劑盒(sigma, MDQ1,Amecica)檢測提取的DNA的甲基化水平；6.用蛋白質(zhì)印跡(western blot)檢測ERK1、DNMT1和CD70蛋白水平；7.采用IMB技術(shù)分離的鼠CD4+T細(xì)胞,分為ERK抑制組、DNNT抑制組、SLE和正常對照組共4組,分別加入特異性ERK抑制劑(U0126)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(氮雜胞苷)共培養(yǎng)72小時,而正常對照組未經(jīng)任何處理。后續(xù)實驗內(nèi)容同前4、5、6。結(jié)果1. MRL/1pr鼠T細(xì)胞中存在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下調(diào)和DNA低甲基化。MRL/1pr鼠外周血T細(xì)胞的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因1表達(dá)顯著低于健康對照組；2. MRL/1pr鼠外周血T細(xì)胞過度表達(dá)甲基化調(diào)控基因CD70。我們用Western Blot、RT-PCR等方法發(fā)現(xiàn),MRL/1pr鼠CD70表達(dá)水平較健康對照組顯著增加;3.DNA甲基化可以調(diào)控多種甲基化敏感基因表達(dá)。特異性DNA甲基化抑制劑氮雜胞苷與MRL/1pr鼠外周血CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)可導(dǎo)致新合成的DNA甲基化水平明顯下降,DNA甲基化敏感基因CD70表達(dá)上調(diào)；4.狼瘡T細(xì)胞基因表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制異常與ERK1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。選擇性有絲分裂原活化蛋白/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶抑制劑U0126抑制正常T細(xì)胞ERK途徑,減少T細(xì)胞DNMT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平,誘導(dǎo)DNA低甲基化,進而調(diào)控甲基化敏感基因CD70表達(dá)。結(jié)論以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機制在SLE疾病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用第3部分骨橋蛋白在SLE腎損害Th17細(xì)胞異常中的作用研究背景系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種以多種炎性細(xì)胞因子參與的多靶器官損害為特征的自身免疫性疾病。特別是系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎損害,免疫復(fù)合物形成、免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子等免疫異常導(dǎo)致的靶器官細(xì)胞浸潤和炎性損傷是其發(fā)病的關(guān)鍵因素。Th17細(xì)胞及其分泌的多種炎性細(xì)胞因子在SLE疾病的免疫紊亂及器官的炎性損傷中有非常重要的作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),SLE患者外周血及受累器官Thl7細(xì)胞及IL-17均高表達(dá)。而且在SLE活動期其表達(dá)更高,而經(jīng)過治療后其表達(dá)有所降低。另外的學(xué)者則發(fā)現(xiàn),不僅SLE患者IL-17的分泌增加和分泌IL-17的CD4+和CD3 CD4 CD8T細(xì)胞增多,而且分泌IL-17的Th17細(xì)胞也存在于SLE患者炎性損傷的腎組織中。研究目的通過研究SLE腎損害患者OPN對CD3+CD8-IL-17A+T細(xì)胞及IL-17分泌的影響,探討OPN在SLE腎損害患者Th17細(xì)胞異常中的作用。方法分別取40例健康人和50例SLE患者(其中,伴腎損害SLE患者25例、無腎損害的SLE患者25例)血清和肝素鈉抗凝血,用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血清中OPN和IL-17的表達(dá)水平,用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中CD3+CD8-IL-17A+T細(xì)胞的陽性率,并分析各組間差異,以及各因素間的相互關(guān)系。結(jié)果①SLE腎損害患者組的OPN、IL-17水平和CD3+CD8-IL-17A+ T細(xì)胞陽性率顯著高于無腎損害的SLE患者組、健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為42.032,25.768,58.878,p均0.01)；無腎損害的SLE患者組和健康對照組間OPN、IL-17、CD3+CD8-IL-17A+T細(xì)胞陽性率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為42.032,25.768,58.878,P均0.05)。②血清中OPN分泌與IL-17水平、CD3+CD8-IL-17A+T細(xì)胞陽性率之間成明顯正相關(guān)(R值分別為0.442、0.630,P值均0.01)。結(jié)論外周血中的OPN對SLE腎損害患者的Th17細(xì)胞異常起著重要的調(diào)控作用。
[Abstract]:Systemic lupus erythematosus ( SLE ) is one of the most common causes of systemic lupus erythematosus ( SLE ) . In order to provide new strategies and targets for the treatment of autoimmune diseases in systemic lupus erythematosus , 10 SLE patients were collected as experimental groups and 10 healthy subjects as control groups , according to the revised SLE classification criteria in 1997 .
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本文編號：1853427