本文選題：H9c2 + 心肌肥厚��； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:本課題通過對大鼠胚胎心肌細(xì)胞(H9c2)進(jìn)行高糖高脂干預(yù),建造糖尿病心肌病肥厚模型,通過檢測MAPK信號蛋白明確其對糖尿病心肌病中炎性反應(yīng)的影響。方法:實驗分為三部分:(1)采用隨機(jī)數(shù)字表法,將體外培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分組,每組設(shè)6個平行孔:對照組、高糖高脂A(葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉250μmol/L)、高糖高脂B(葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉500μmol/L)、高糖高脂C(葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉1000μmol/L)不同時間(12h、24h、36h、48h)處理組。采用熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)分別檢測心肌肥大相關(guān)指標(biāo)心房鈉尿肽(ANP)、α-肌動蛋白(α-SKA)的m RNA表達(dá);利用蘇木精-伊紅染色法(HE染色)對各組細(xì)胞進(jìn)行染色,觀察高糖高脂對H9c2心肌細(xì)胞肥大程度的影響;檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活性,觀察高糖高脂對H9c2心肌細(xì)胞損傷程度的影響。(2)結(jié)合第一部分實驗,采用隨機(jī)數(shù)字表法,將體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞分組,每組設(shè)立6個平行對照孔:對照組、高糖高脂組(葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉500μmol/L)處理24小時。利用蛋白免疫印跡(Western blot)技術(shù)檢測p-ERK/T-ERK、p-JNK/T-JNK、p-p38/T-p38的活化程度,觀察高糖高脂與MAPK家族信號活化關(guān)系。(3)結(jié)合前兩部分實驗,采用隨機(jī)數(shù)字表法,將體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞分組,每組設(shè)立6個平行對照孔,對照組、高糖高脂組、抑制劑組(SB203580+高糖高脂組)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞中活性氧(ROS)的含量;通過化學(xué)檢測法檢測各組一氧化氮(NO)的水平;ELISA法檢測各組細(xì)胞3-硝基酪氨酸(3-NT)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)的分泌程度,觀察高糖高脂對H9c2心肌細(xì)胞炎癥通路的影響及MAPK家族與炎性反應(yīng)之間的關(guān)系。結(jié)果:1.高糖高脂處理導(dǎo)致H9c2細(xì)胞呈時間和濃度依賴性肥大和損傷。與對照組相比,高糖高脂處理后,ANP表達(dá)隨著濃度和時間的逐漸增加而升高,且在36h高糖高脂B處理組ANP的表達(dá)量達(dá)到高峰(P0.01);相比對照組而言,高糖高脂促進(jìn)α-SKA表達(dá),但α-SKA的表達(dá)在36h高糖高脂B處理組達(dá)到最高(P0.05),與ANP的結(jié)果一致;與對照組相比,H9c2細(xì)胞的表面積變化與高糖高脂呈時間濃度依賴性,此外在36h高糖高脂B處理組,細(xì)胞的表面積變化最顯著(P0.01),但36h高糖高脂C處理組的細(xì)胞形態(tài)改變異常;同時H9c2細(xì)胞上清中LDH的活性與高糖高脂處理間呈濃度及時間依賴性(P0.05)。據(jù)此,采用高糖高脂B(葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉500μmol/L)干預(yù)細(xì)胞36h為后續(xù)實驗的干預(yù)濃度和時間。2.高糖高脂處理后H9c2細(xì)胞MAPK信號途徑顯著活化。與對照組相比,高糖高脂組中ERK、JNK、p38磷酸化水平明顯提高,其中p-ERK和p-JNK的水平分別增加了1.39倍和1.47倍(P0.05),而p-p38的活化水平增加了3.34倍(P0.01)。3.高糖高脂顯著誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)變化并可被p38 MAPK抑制劑抑制。與高糖高脂組相比,抑制劑組(SB203580+高糖高脂組)可降低ROS含量、NO水平、3-NT含量、IL-6和IL-1β的分泌量(P0.05)。結(jié)論:1.高糖高脂可增加ANP及α-SKA的表達(dá)并使H9c2細(xì)胞表面積顯著增加,且可使細(xì)胞上清中的LDH水平升高,這提示高糖高脂可顯著誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞肥大并使其發(fā)生損傷。2.高糖高脂可以增加MAPK家族活化程度,其中p38尤為明顯,提示在糖尿病心肌病的發(fā)生過程中伴隨有炎性信號通路活化。3.p38抑制劑可抑制高糖高脂誘導(dǎo)的ROS、NO、3-NT、IL-6、IL-1β水平的提高,提示p38 MAPK是介導(dǎo)高糖高脂導(dǎo)致糖尿病心肌病病理過程發(fā)生發(fā)展炎性反應(yīng)的重要因素。
[Abstract]:Objective: to construct a hyperglycemic and hyperlipidemic model of diabetic cardiomyocytes (H9c2) to construct a hyperlipidemic model of diabetic cardiomyopathy, and to determine the effect of MAPK signal protein on the inflammatory response in diabetic cardiomyopathy. Methods: the experiment was divided into three parts: (1) the random digital table was used, and the H9c2 cardiomyocytes were randomly cultured in vitro. There were 6 parallel holes in each group: the control group, high sugar and high fat A (glucose 33mmol/L+ sodium palmitate 250 mol/L), high sugar and high fat B (glucose 33mmol/L+ palmitate sodium 500 u mol/L), high sugar and high fat C (dextrose 33mmol/L+ palmitate sodium 1000 mol/L) at different time (12h, 24h, 36h,) treatment group. Muscle hypertrophy related indexes of M RNA expression of atrial natriuretic peptide (ANP) and alpha actin (alpha -SKA); the effects of high glucose and high fat on the degree of hypertrophy of H9c2 cardiomyocytes by hematoxylin eosin staining (HE staining), and the activity of lactate dehydrogenase (LDH) in cell culture fluid, and the damage of high fat and high fat to H9c2 myocardial cells were observed. (2) combined with the first part of the experiment, the H9c2 myocardial cells were grouped in vitro with 6 parallel control holes in each group: control group, high glucose and high fat group (glucose 33mmol/L+ sodium palmitate 500 mol/L) for 24 hours. P-ERK/T-ERK, p-JNK/T-JNK, P were detected by protein immunoblotting (Western blot). The activation degree of -p38/T-p38 was observed. (3) combined with the first two parts of the experiment, the H9c2 myocardial cells were grouped in the first two parts, and 6 parallel control holes were set up in each group, the control group, the high sugar and high fat group and the inhibitor group (SB203580+ high fat group). The flow cytometry was used to detect each group. The content of active oxygen (ROS) in cells was detected by chemical detection, and the level of nitric oxide (NO) was detected by chemical detection. The secretory degree of 3- nitrotyrosine (3-NT), interleukin -6 (IL-6), and interleukin -1 beta (IL-1 beta) was detected by ELISA, and the relationship between high glucose and high fat on the inflammatory pathway of H9c2 cardiac myocytes and the relationship between MAPK family and inflammatory reaction was observed. Results: 1. high glucose and high fat treatment resulted in time and concentration dependent hypertrophy and injury of H9c2 cells. Compared with the control group, the expression of ANP increased with the increase of concentration and time, and the expression of ANP in the high glucose and high fat B treatment group of 36h reached the peak (P0.01). Compared with the control group, high sugar and high fat promoted the alpha -SKA table. But the expression of alpha -SKA was highest in 36h high fat B treatment group (P0.05), consistent with the result of ANP. Compared with the control group, the surface area changes of H9c2 cells were time dependent on high glucose and high fat, and the surface area of the cells in the 36h high fat and high fat B treatment group was the most significant (P0.01), but the cell morphology of the 36h high sugar and high fat C treatment group At the same time, the activity of LDH in H9c2 cell supernatant was dependent on the concentration and time dependence between high glucose and high fat treatment (P0.05). Accordingly, the intervention concentration and time of high fat and high fat B (glucose 33mmol/L+ palmitate 500 u mol/L) were used as the intervention concentration and time of.2. high glucose and high fat treatment, and the H9c2 cell MAPK signaling pathway was significantly activated. Compared with the control group, the level of ERK, JNK and p38 phosphorylation in the high glucose and high fat group increased significantly, in which the levels of p-ERK and p-JNK increased by 1.39 and 1.47 times respectively (P0.05), while the activation level of p-p38 increased by 3.34 times (P0.01).3. high sugar and high fat significantly induced the changes of the inflammatory reaction and could be inhibited by p38 MAPK inhibitor. Compared with the high glucose and high fat group, the inhibitor was inhibited. Group (SB203580+ high glucose group) could reduce the content of ROS, NO, 3-NT, IL-6 and IL-1 beta secretion (P0.05). Conclusion: 1. high sugar and high fat can increase the expression of ANP and alpha -SKA and increase the surface area of H9c2 cells significantly, and can increase the LDH level in the cell supernatant, which suggests that high sugar and high fat can significantly induce H9c2 cells hypertrophy and make it hair. .2. high glucose and high fat can increase the degree of activation of MAPK family, especially p38, suggesting that the activation of.3.p38 inhibitors with inflammatory signaling pathway in the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy can inhibit high glucose and high lipid induced ROS, NO, 3-NT, IL-6, and IL-1 beta levels, suggesting that p38 MAPK is the mediating high glucose and high fat to lead to diabetic myocardium Pathological processes play an important role in the development of inflammatory response.

【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R542.2

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本文編號：1844924