本文選題：BAFF + IL-15�。� 參考：《吉林大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：背景： B細(xì)胞不僅能夠產(chǎn)生致病性抗體，而且它們還具有多樣的效應(yīng)功能，包括抗原的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)，抗原遞呈到T細(xì)胞，細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，以及遷移至炎癥部位，所以B細(xì)胞已經(jīng)成為自身免疫性疾病的“罪魁禍?zhǔn)住�。BAFF是調(diào)節(jié)B細(xì)胞成熟、存活和功能的決定性因素。在動(dòng)物模型中，BAFF過表達(dá)能夠?qū)е伦陨砻庖咝约膊〉陌l(fā)展；并且與正常健康人相比，自身免疫性疾病病人中BAFF的濃度均明顯升高。在SLE中，BAFF的致病作用已經(jīng)顯示：BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠能夠產(chǎn)生抗雙鏈DNA（anti-double-strandedDNA，anti-dsDNA）抗體和發(fā)展成腎小球腎炎的狼瘡樣疾病。已有的研究表明：BAFF增加的水平與自身免疫性疾病的活動(dòng)度具有相關(guān)性。在MS病人中，BAFF是通過星形膠質(zhì)細(xì)胞來表達(dá)的，這些星形膠質(zhì)細(xì)胞與存在于腦膜異位淋巴濾泡內(nèi)的B細(xì)胞活化因子受體（B-cell activating factor receptor，BAFF-R）表達(dá)細(xì)胞具有密切聯(lián)系。所以，BAFF已經(jīng)成為了許多自身免疫性疾病的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。BAFF抑制可造成CD20+幼稚B細(xì)胞的數(shù)目，活化B細(xì)胞和漿母細(xì)胞，結(jié)果導(dǎo)致了記憶B細(xì)胞數(shù)目的短暫增加。只要這種反應(yīng)性記憶是持續(xù)存在的，那么原則上體液免疫反應(yīng)就能夠通過免疫記憶從而得以修復(fù)，因此研究BAFF調(diào)節(jié)記憶B細(xì)胞的機(jī)制是至關(guān)重要的。IL-15能夠在抗原缺失的條件下提供維持記憶T細(xì)胞和B細(xì)胞存活的信號(hào)，但是BAFF是否能夠通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞中IL-15的表達(dá)從而影響自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展的作用機(jī)制尚不清楚。 目的： 探討B(tài)AFF調(diào)節(jié)B細(xì)胞中IL-15表達(dá)的作用機(jī)制，證明BAFF抑制劑和抗IL-15抗體聯(lián)合治療能夠成為徹底根治自身免疫性疾病和降低疾病復(fù)發(fā)率的有效治療方案，并為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。 方法和結(jié)果： 1.我們對(duì)SLE、MS病人和它們的動(dòng)物模型進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)BAFF在自身免疫性疾病中的表達(dá)水平是增加的。我們應(yīng)用TACI-IgG體內(nèi)治療EAE和狼瘡樣小鼠，以達(dá)到阻斷BAFF的目的，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（Fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay，，ELISA）和實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（Real-time Quantitative PCR Detecting System，qPCR）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：EAE小鼠中，B細(xì)胞數(shù)目減少和自身抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)減輕；狼瘡樣小鼠中，成熟B細(xì)胞數(shù)目和anti-dsDNA抗體滴度是降低的。另外，我們利用記憶B細(xì)胞分離試劑盒使用兩步法分離小鼠中的記憶B細(xì)胞，通過計(jì)數(shù)每只小鼠的絕對(duì)記憶B細(xì)胞數(shù)目發(fā)現(xiàn)：在EAE和狼瘡樣小鼠中，TACI-IgG治療能夠明顯上調(diào)記憶B細(xì)胞數(shù)目。這些結(jié)果表明接受貝利單抗或TACI-IgG治療的病人，循環(huán)中記憶B細(xì)胞的總數(shù)目是相對(duì)恒定的，或者有的時(shí)候甚至是增加的，這與臨床研究的結(jié)果是一致的。 2. IL-15是記憶T和B細(xì)胞生存和維持的重要細(xì)胞因子。因此，我們推斷：在狼瘡樣小鼠中，TACI-IgG將BAFF封閉，從而通過誘導(dǎo)IL-15上調(diào)記憶B細(xì)胞。我們應(yīng)用TACI-IgG體內(nèi)治療EAE和狼瘡樣小鼠，并從其中分離血清、脾和淋巴結(jié)，應(yīng)用FACS、ELISA和qPCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：IL-15主要表達(dá)于脾臟中，TACI-IgG治療能夠上調(diào)IL-15表達(dá)；同時(shí)，我們也分離了TACI-IgG治療的EAE和狼瘡樣小鼠的B細(xì)胞，同樣發(fā)現(xiàn)TACI-IgG治療能夠上調(diào)B細(xì)胞中IL-15的表達(dá)。因此，我們推測(cè)TACI-IgG是否通過上調(diào)B細(xì)胞從而誘導(dǎo)IL-15的表達(dá)。在經(jīng)過TACI-IgG治療的EAE和狼瘡樣小鼠中，我們用anti IL-15抗體封閉了IL-15，發(fā)現(xiàn)記憶B細(xì)胞數(shù)目明顯減少，這為BAFF抑制劑和抗IL-15抗體聯(lián)合治療自身免疫性疾病的臨床應(yīng)用提供了證據(jù)。 3.為了明確BAFF和APRIL對(duì)B細(xì)胞上IL-15表達(dá)的影響，我們使用自身抗原雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）聯(lián)合BAFF或APRIL來刺激狼瘡樣小鼠的B細(xì)胞，應(yīng)用qPCR和FACS方法分析顯示：當(dāng)dsDNA刺激狼瘡樣小鼠B細(xì)胞后，BAFF能夠明顯的抑制IL-15的表達(dá)，但APRIL卻不能。我們使用MOG35 55（myelin oligodendrocyteglycoprotein，髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白）聯(lián)合BAFF刺激EAE小鼠B細(xì)胞，應(yīng)用qPCR和FACS方法分析顯示：在MOG35 55刺激EAE小鼠B細(xì)胞，BAFF明顯抑制IL-15的表達(dá)。相比之下，BAFF也能夠輕微地抑制野生型小鼠B細(xì)胞中IL-15的表達(dá)。另外，我們又使用了不同條件，如脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）或免疫球蛋白M抗體（anti-immuneglobulin M，anti-IgM）刺激來源于野生型小鼠的B細(xì)胞，qPCR分析顯示：野生型小鼠的B細(xì)胞在LPS或者anti-IgM刺激條件下，BAFF能夠抑制IL-15的表達(dá)。同樣地，來源于健康人的B細(xì)胞在經(jīng)過anti-IgM刺激之后，BAFF也能夠抑制IL-15的表達(dá)。這些結(jié)果表明：在不同刺激條件下誘導(dǎo)B細(xì)胞，BAFF都能夠抑制IL-15的表達(dá)。此外，BAFF是通過CD19+B細(xì)胞抑制IL-15的分泌，而與CD4+T細(xì)胞無關(guān)。 4.在BAFF抑制IL-15表達(dá)過程中，哪一類脾臟B細(xì)胞是關(guān)鍵的，這是需要亟待解決的問題。我們將自身抗原MOG35 55聯(lián)合BAFF刺激來源于對(duì)照組和EAE小鼠的B細(xì)胞。通過FACS分析B細(xì)胞的不同分群，結(jié)果顯示：在過渡期2階段B細(xì)胞（Transitional2stage B cells，T2B）中，IL-15呈高表達(dá)，而過渡期1階段B細(xì)胞（Transitional1stageB cells，T1B）、邊緣區(qū)B細(xì)胞（marginal zone B cells，MZB）和濾泡B細(xì)胞（follicularB cells，F(xiàn)B）中，IL-15呈低表達(dá)。在這些細(xì)胞類型中，BAFF是通過T2B細(xì)胞來抑制IL-15表達(dá)的。然而，我們通過FACS和qPCR方法檢測(cè)經(jīng)過BAFF治療的小鼠B細(xì)胞中分選T1B、T2B、FB和MZB細(xì)胞，結(jié)果也顯示：IL-15主要表達(dá)于T2B細(xì)胞，另外，在T2B細(xì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和T2B細(xì)胞向FB細(xì)胞轉(zhuǎn)化。這些結(jié)果均證明：BAFF能夠通過分泌IL-15抑制T2B細(xì)胞，從而促進(jìn)T2B向成熟B細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 5.調(diào)控T2B細(xì)胞中IL-15表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子有哪些？qPCR結(jié)果顯示：叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1（forkhead transcription factor1，F(xiàn)oxo1）主要表達(dá)于T2B細(xì)胞中，這與IL-15的表達(dá)是一致的。同時(shí)我們使用Foxo1-特定的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）來減少B細(xì)胞中Foxo1的表達(dá)，然后分選T2B細(xì)胞，qPCR分析顯示：與Foxo1-未減少的T2B細(xì)胞相比，F(xiàn)oxo1-減少的T2B細(xì)胞中IL-15呈低表達(dá)，而當(dāng)B細(xì)胞中Foxo1過表達(dá)時(shí)，F(xiàn)oxo1能夠上調(diào)IL-15mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)。這些結(jié)果表明：在T2B細(xì)胞中，F(xiàn)oxo1調(diào)節(jié)IL-15的表達(dá)。 6.為了證明Foxo1直接調(diào)節(jié)IL-15的表達(dá)，我們構(gòu)建了包含IL-15啟動(dòng)子區(qū)域的六個(gè)熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3。通過雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)分析，我們發(fā)現(xiàn)Foxo1限制了IL-15啟動(dòng)子上游1500到1800bp的區(qū)域。之后，我們檢測(cè)了BAFF是否抑制了Foxo1表達(dá)。我們使用自身抗原dsDNA或MOG35 55聯(lián)合BAFF分別刺激來源于狼瘡樣或EAE小鼠的B細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：BAFF能夠明顯抑制Foxo1表達(dá)。為了進(jìn)一步證明這些結(jié)果，我們使用不同的條件如LPS或anti-IgM來刺激來源于野生型小鼠的B細(xì)胞，qPCR分析顯示BAFF抑制B細(xì)胞中Foxo1表達(dá)。同樣地，anti-IgM刺激來源于健康人的B細(xì)胞，BAFF也同樣抑制人B細(xì)胞中Foxo1表達(dá)。這些結(jié)果表明：在不同的刺激條件下，BAFF都能夠抑制Foxo1表達(dá)。我們也使用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB）方法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：在CD19+B細(xì)胞中BAFF能夠抑制Foxo1表達(dá)。另外，我們發(fā)現(xiàn)：BAFF誘導(dǎo)Foxo1磷酸化，這表明BAFF通過減少Foxo1磷酸化，從而減少核內(nèi)Foxo1水平。此外，通過TACI-IgG封閉BAFF能夠誘導(dǎo)來源于EAE和狼瘡樣小鼠B細(xì)胞中Foxo1的表達(dá)。這些結(jié)果共同表明：在B細(xì)胞中，BAFF通過下調(diào)Foxo1表達(dá)，從而抑制IL-15表達(dá)。 結(jié)論： 1. TACI-IgG是通過有效地減少循環(huán)中成熟B細(xì)胞數(shù)目而發(fā)揮作用的，但是記憶B細(xì)胞的持續(xù)存在和明顯上調(diào)可能是自身免疫性疾病難以治愈和反復(fù)發(fā)作的重要原因。 2.在B細(xì)胞中，TACI-IgG治療是通過誘導(dǎo)IL-15從而上調(diào)記憶B細(xì)胞，而anti IL-15抗體能夠有效地減少經(jīng)過TACI-IgG治療的狼瘡樣和EAE小鼠中記憶B細(xì)胞的數(shù)目，因此，TACI-IgG和anti IL-15抗體可聯(lián)合用于治療狼瘡樣小鼠和EAE小鼠。 3. B細(xì)胞中，BAFF通過下調(diào)Foxo1表達(dá)，從而抑制IL-15表達(dá)，所以Foxo1是調(diào)控T2B細(xì)胞中IL-15表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)BAFF促進(jìn)B細(xì)胞成熟時(shí)，它能夠通過調(diào)節(jié)Foxo1 IL-15信號(hào)途徑從而抑制記憶B細(xì)胞，這顯示Foxo1積極地抑制促進(jìn)記憶B細(xì)胞發(fā)育的效應(yīng)器或終末分化。 4. TACI-IgG聯(lián)合抗IL-15抗體治療狼瘡樣小鼠能夠有效減少記憶B細(xì)胞數(shù)目和降低抗dsDNA抗體的滴度，這對(duì)于自身免疫性疾病的治療是必需的，并為人類自身免疫性疾病的臨床應(yīng)用提供了證據(jù)。
[Abstract]:Background :

B cells can not only produce pathogenic antibodies , but also have various effector functions including antigen uptake , transport , antigen presentation to T cells , cytokines and chemokine production , and migration to inflammatory sites , so B cells have become the " culprit " of autoimmune diseases . BAFF is a decisive factor regulating the maturation , survival and function of B cells . In animal models , overexpression of BAFF can lead to the development of autoimmune diseases ;
BAFF has become a new therapeutic target for many autoimmune diseases .

Purpose :

To investigate the mechanism of BAFF in regulating the expression of IL - 15 in B cells , it is proved that the combination therapy of BAFF inhibitor and anti - IL - 15 antibody can be an effective treatment scheme for radically curing autoimmune diseases and reducing the recurrence rate of diseases , and provides a theoretical basis for clinical application .

Methods and Results :

1.鎴戜滑瀵筍LE,MS鐥呬漢鍜屽畠浠殑鍔ㄧ墿妯″瀷榪涜浜嗙爺絀

本文編號(hào)：1818066