發(fā)布時間：2018-04-18 16:52

  本文選題：人Cosmc胞外段 + 昆蟲細(xì)胞　； 參考：《中國免疫學(xué)雜志》2016年10期

【摘要】：目的:利用昆蟲細(xì)胞Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人Cosmc胞外段蛋白,為體外研究Cosmc蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ),同時也為O-連接糖基化及相關(guān)疾病的研究提供思路。方法:采用Bac-to-Bac系統(tǒng),構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒p FastBac1-Cosmc extracellular domain(p Fast Bac1-Cosmc ED),轉(zhuǎn)化到含穿梭載體Bacmid的感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac中,通過藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定,獲得重組轉(zhuǎn)座子r Bacmid-Cosmc ED。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下,重組病毒感染Sf-9無血清細(xì)胞,在Sf-9中表達(dá)Cosmc胞外段蛋白,由于Cosmc N端加有昆蟲細(xì)胞信號肽HBM(Honey Bee Melittin)且不含有跨膜段,所以Cosmc胞外段蛋白表達(dá)后分泌到培養(yǎng)基上清中,通過SDS-PAGE和Western blot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測,并通過Ni-NTA親和層析柱對其進(jìn)行純化分析。結(jié)果:SDS-PAGE和Western blot分析顯示得到一條分子量約為33 k D的特異性條帶,與目的蛋白大小相符,質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)一步證明所得蛋白為Cosmc胞外段蛋白。結(jié)論:Sf-9細(xì)胞中可成功表達(dá)Cosmc胞外段蛋白,為進(jìn)一步研究Cosmc的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: to express human Cosmc extracellular segment protein by using insect cell Bac-to-Bac baculovirus expression system, and to lay a foundation for the study of the structure and function of Cosmc protein in vitro, and to provide a way for the study of O- linked glycosylation and related diseases.Methods: the recombinant transfer plasmid p FastBac1-Cosmc extracellular domain(p Fast Bac1-Cosmc was constructed by Bac-to-Bac system and transformed into the competent DH10Bac containing shuttle vector Bacmid. The recombinant transposon r Bacmid-Cosmc ED was obtained by blue and white spot screening and PCR identification.The recombinant virus was infected with Sf-9 serum-free cells mediated by liposome, and expressed extracellular segment protein of Cosmc in Sf-9. Due to the addition of HBM(Honey Bee Melittinin, an insect cell signal peptide was added to the N-terminal of Cosmc and did not contain transmembrane segments.So the extracellular segment protein of Cosmc was expressed and secreted into the supernatant of culture medium. The expression product was detected by SDS-PAGE and Western blot, and purified by Ni-NTA affinity chromatography.Results A specific band with molecular weight of about 33 KD was obtained by the analysis of Western blot and 7% SDS-PAGE, which was consistent with the size of the target protein. The result of mass spectrometry further confirmed that the protein was an extracellular segment of Cosmc.Conclusion the extracellular segment protein of Cosmc can be expressed successfully in Sf-9 cells, which lays a foundation for further study on the structure and function of Cosmc.
【作者單位】： 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心風(fēng)濕免疫科;
【基金】：上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金創(chuàng)新資金資助(No.PKJ2012-Y51)
【分類號】：R593.2

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本文編號：1769256