本文選題：足細(xì)胞 + 高糖　； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景:Ras 相關(guān)的 C3 肉毒素底物 1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)是Rho家族小G蛋白成員之一,在細(xì)胞粘附,增殖以及細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等一系列細(xì)胞生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。過度激活的Rac1參與氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)等病理過程,與糖尿病腎病的發(fā)病及病情發(fā)展密切相關(guān)。研究表明,在一定損傷下足細(xì)胞可能通過上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)這一機(jī)制發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能紊亂、腎小球?yàn)V過膜的破壞以及蛋白尿的發(fā)生。而Rac1可能通過活化p21活化激酶1(p21-activated kinase 1,PAK1)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)等下游重要的效應(yīng)激酶參與腫瘤細(xì)胞EMT過程。P38MAPK為MAPK家族成員之一,參與產(chǎn)生炎癥介質(zhì)及調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架穩(wěn)定性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),高糖環(huán)境可通過激活p38 MAPK誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,參與糖尿病腎病腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展,而靶向p38MAPK的重組質(zhì)�？捎行Ц蓴_p38MAPK基因表達(dá),阻斷EMT的發(fā)生。因此,本研究以條件永生化小鼠足細(xì)胞系及構(gòu)建足細(xì)胞特異性Rac1 RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠(transgenic mice,TGmice)作為研究對(duì)象,觀察并探討Rac1/PAK1/p38 MAPK信號(hào)通路的激活在高糖刺激誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT及糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生過程中的作用機(jī)制,Rac1信號(hào)通路與EMT中重要轉(zhuǎn)錄因子β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的相互關(guān)系,以及靶向抑制足細(xì)胞Rac1活性水平對(duì)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷以及蛋白尿的保護(hù)作用,為臨床早期預(yù)防和治療糖尿病腎病提供新的理論依據(jù)和新的思路。第一部分 Rac1在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用機(jī)制目的:1.明確高糖環(huán)境是否導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生EMT。2.明確足細(xì)胞發(fā)生EMT是否導(dǎo)致其功能障礙,影響其屏障功能。3.探討Rac1信號(hào)通路參與高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT的發(fā)生機(jī)制。4.探討調(diào)控Rac1信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT的影響。方法:1.細(xì)胞培養(yǎng):體外培養(yǎng)永生化小鼠足細(xì)胞系(由哈佛醫(yī)學(xué)院Peter Mundel教授惠贈(zèng),北京大學(xué)丁潔教授轉(zhuǎn)贈(zèng))。在Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶內(nèi),在條件下,用RPMI 1640(10%胎牛血清)+10 U/ml重組小鼠γ-干擾素,于33℃C培養(yǎng)足細(xì)胞增殖;用不含γ-干擾素培養(yǎng)基37℃C培養(yǎng)足細(xì)胞14天促進(jìn)其分化成熟。2.檢測(cè)高糖(30mmol/l)刺激前后足細(xì)胞EMT指標(biāo)及足細(xì)胞功能:(1)倒置相差顯微鏡明確足細(xì)胞形態(tài)學(xué)是否變化;(2)western blot、real time PCR及細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)足細(xì)胞標(biāo)志蛋白p-cadherin、ZO-1及間充質(zhì)細(xì)胞樣表型標(biāo)志物FSP-1、α-SMA、desmin的表達(dá)變化;(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高糖培養(yǎng)條件下足細(xì)胞凋亡情況;(4)Transwell小室檢測(cè)白蛋白流入量,評(píng)價(jià)足細(xì)胞的單層屏障功能;(5)Transwell檢測(cè)足細(xì)胞遷移率以及FITC-鬼筆環(huán)肽(FITC-phalloidin)染色鑒定足細(xì)胞F-actin細(xì)胞骨架變化。3.Rac1/PAK1/p38MAPK信號(hào)通路檢測(cè):(1)Rac1 shRNA載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及基因敲低效率的鑒定:①熒光顯微鏡觀察陽性轉(zhuǎn)染率;②western blot及real time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后足細(xì)胞Rac1蛋白及mRNA表達(dá)水平;(2)抑制劑IPA-3及SB203580的配制:將粉末試劑溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配制成儲(chǔ)存液,保存于-20℃C。用于處理細(xì)胞時(shí),首先以DMSO進(jìn)一步稀釋,然后計(jì)算加入體積確保培養(yǎng)基內(nèi)抑制劑終濃度為10μM;(3)GST Pull-down assay檢測(cè)Rac1活性;(4)western blot檢測(cè)不同處理組足細(xì)胞內(nèi)PAK1及p38 MAPK磷酸化水平。4.檢測(cè)調(diào)控Rac1信號(hào)通路對(duì)足細(xì)胞EMT及功能的影響:(1)檢測(cè)調(diào)控Rac1信號(hào)通路后足細(xì)胞EMT指標(biāo)及功能變化;(2)western blot、細(xì)胞免疫熒光等檢測(cè)不同處理組轉(zhuǎn)錄因子β-catenin、Snail表達(dá)水平變化。(3)明確Rac1信號(hào)通路與β-catenin的相互作用:①構(gòu)建激活型Rac1(CA-Rac1)、野生型Rac1(WT-Rac1)、失活型 Rac1(DN-Rac1)三種 Rac1 表達(dá)質(zhì)粒;②構(gòu)建 β-catenin表達(dá)質(zhì)粒(Flag-β-catenin)以及空對(duì)照質(zhì)粒;③共轉(zhuǎn)染Rac1表達(dá)質(zhì)粒與β-catenin表達(dá)質(zhì)粒;④免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,CO-IP)檢測(cè) Rac1/PAK1 與β-catenin的相互作用;⑤體外激酶實(shí)驗(yàn)(in vito kinase assay)檢測(cè)p38 MAPK與β-catenin之間的相互作用。結(jié)果:1.高糖培養(yǎng)48小時(shí)后標(biāo)志性蛋白p-cadherin和ZO-1表達(dá)明顯減少(P0.01)而間充質(zhì)樣蛋白FSP-1、α-SMA及desmin出現(xiàn)重新表達(dá)(P0.01);Transwell小室白蛋白流入量顯著增加(P0.01),同時(shí)F-actin骨架蛋白出現(xiàn)明顯的邊集現(xiàn)象,伴隨足細(xì)胞遷移率顯著增高(P0.01)。2.高糖刺激48小時(shí)導(dǎo)致了 Rac1蛋白的激活(P0.01),以及PAK1、p38 MAPK磷酸化水平的增高(P0.01);同時(shí)引起β-catenin的N端去磷酸化、Snail表達(dá)增加(P0.05),以及β-catenin細(xì)胞核遷移。3.Rac1 shRNA顯著抑制了足細(xì)胞EMT指標(biāo)的發(fā)生(P0.05),部分修正了足細(xì)胞功能損傷(P0.05);同時(shí)明顯減少了 PAK1、p38 MAPK磷酸化水平(P0.05),降低了轉(zhuǎn)錄因子β-catenin、Snail活性(P0.05),并部分阻斷了β-catenin核遷移;抑制劑IPA-3及SB203580對(duì)Rac1活性均無顯著影響(P0.05),且SB203580對(duì)PAK1磷酸化無抑制作用(P0.05)。4.Rac1對(duì)β-catenin的C端絲氨酸位點(diǎn)具有直接磷酸化修飾作用,這一作用導(dǎo)致β-catenin泛素化水平降低;同時(shí),p38 MAPK通過磷酸化下游信號(hào)分子MEF2c 來結(jié)合 β-catenin。結(jié)論:1.高糖導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生EMT及功能障礙。2.Rac1通過激活下游信號(hào)分子PAK1/p38 MAPK參與高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT。3.高糖條件下Rac1/PAK1/p38 MAPK信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子β-catenin活性與遷移,影響EMT相關(guān)基因及蛋白表達(dá),從而導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化。4.調(diào)控Rac1/PAK1/p38 MAPK信號(hào)通路可阻斷足細(xì)胞EMT的發(fā)生第二部分足細(xì)胞特異性Rac1RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠的建立與鑒定目的:構(gòu)建與鑒定足細(xì)胞特異性Rac1 RNAi TG小鼠。方法:1.構(gòu)建足細(xì)胞特異性Rac1 shRNA載體:(1)PCR擴(kuò)增Nephrin啟動(dòng)子及mirRac1 序列;(2)利用酶切連接構(gòu)建 pUp-Nephrin 和 pDown-SM30/mirRac1;(3)利用 gateway technology 構(gòu)建 pLV.EX2d.null-NephrinSM30/mirRac1 表達(dá)質(zhì)粒。2.獲得足細(xì)胞特異的Rac1 RNAi TG小鼠:(1)建立F0小鼠:①利用酶切將載體進(jìn)行DNA線性化并提純;②通過DNA顯微注射受精卵獲取新生小鼠;③基因分型PCR鑒定陽性者為已整合外源基因的TG小鼠F0;(2)F0小鼠與C57BL/6野生型小鼠雜交與傳代,鼠尾DNA提取及基因分型PCR篩選實(shí)驗(yàn)用TG小鼠。3.靶向敲低Rac1效率鑒定:(1)免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)Rac1、synaptopodin在野生型(wide type,WT)與TG小鼠腎臟組織中的表達(dá);(2)western blot及real time PCR檢測(cè)WT和TG小鼠原代足細(xì)胞中Rac1的表達(dá)。結(jié)果:1.獲得鼠尾DNA PCR產(chǎn)物陽性的足細(xì)胞特異TG小鼠。2.Rac1蛋白在TG小鼠腎臟組織中表達(dá)明顯少于WT小鼠,而synaptopodin的表達(dá)不受外源基因整合的影響。3.TG小鼠原代足細(xì)胞中Rac1蛋白和mRNA水平較WT小鼠顯著降低(P0.05)。結(jié)論:成功構(gòu)建足細(xì)胞特異性Rac1 RNAi TG小鼠。第三部分靶向抑制Rac1信號(hào)通路對(duì)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用目的:1.構(gòu)建野生型以及Rac1 RNAi轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠模型。2.探討足細(xì)胞靶向抑制Rac1對(duì)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。3.探討足細(xì)胞靶向抑制Rac1對(duì)糖尿病腎病蛋白尿及腎臟的保護(hù)作用。方法:1.建立WT和TG糖尿病小鼠模型:(1)以鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(WT-STZ/TG-STZ),或無菌檸檬酸緩沖液進(jìn)行腹腔注射作為對(duì)照(WT-control/TG-control);(2)鼠尾靜脈采血測(cè)定血糖≥16.7mmol即為造模成功。2.造模成功后4W-12W檢測(cè)指標(biāo):體重、收縮壓、血糖、24h尿蛋白定量等。3.糖尿病腎臟病變檢測(cè):(1)透射電鏡測(cè)定足細(xì)胞數(shù)、足突融合率以及基底膜的平均厚度變異情況;(2)免疫熒光雙標(biāo)法或免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)測(cè)定足細(xì)胞裂孔膜(slit diaphragm,SD)蛋白p-cadherin和ZO-1,間充質(zhì)樣蛋白FSP-1、α-SMA、desmin及基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases,mmp9)的表達(dá)變化;(3)PAS染色觀察腎組織病理改變;(4)IHC檢測(cè)WT-1蛋白表達(dá)及足細(xì)胞凋亡情況。4.GST pull-down檢測(cè)原代足細(xì)胞中Rac1蛋白活性;western blot檢測(cè)PAK1及p38 MAPK磷酸化水平。結(jié)果:1.WT-STZ小鼠6W時(shí)電鏡示足細(xì)胞出現(xiàn)足突輕度融合;免疫熒光雙標(biāo)顯示SD蛋白p-cadherin和ZO-1表達(dá)開始降低,desmin表達(dá)增加;原代足細(xì)胞中Rac1蛋白活性顯著提高,PAK1與p38MAPK磷酸化水平增加(P0.01);8W時(shí)出現(xiàn)mmp9表達(dá)及蛋白尿(P0.05);12W時(shí)足突明顯融合,mmp9表達(dá)及蛋白尿水平明顯加重(P0.01),同時(shí)出現(xiàn)FSP-1重新表達(dá)。2.各觀察時(shí)間段內(nèi)WT-STZ組體重分別較WT-control組顯著下降(P0.01);4W-8W時(shí)TG-STZ組較WT-STZ組體重有所上升(P0.05)。3.電鏡顯示各觀察時(shí)間段內(nèi)TG-STZ組均較WT-STZ組足突融合減輕;免疫熒光提示足細(xì)胞標(biāo)志指標(biāo)p-cadherin及ZO-1表達(dá)水平回升;desmin,mmp9與FSP-1明顯減少。4.6W時(shí)TG-STZ較WT-STZ原代足細(xì)胞GTP-Rac1表達(dá)減少,同時(shí)PAK1與p38 MAPK磷酸化水平顯著減少(P0.05)。5.各觀察時(shí)間段TG-STZ組均較WT-STZ組蛋白尿顯著減少(P0.05),同時(shí)PAS示腎小球基底膜(glomerular basement membrane,,GBM)與系膜區(qū)病變程度降低。6.各觀察時(shí)間段TG-STZ與WT-STZ小鼠血糖血壓無顯著差別(P0.05);四組組間足細(xì)胞數(shù)量無顯著差異(P0.05)。結(jié)論:1.糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生繼發(fā)于足細(xì)胞損傷。2.足細(xì)胞靶向抑制Rac1通過滅活下游PAK1及p38 MAPK蛋白、恢復(fù)SD蛋白表達(dá)與功能,并逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞去分化而發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用。3.足細(xì)胞靶向抑制Rac1通過保護(hù)足細(xì)胞減少蛋白尿,通過減緩GBM和系膜區(qū)的病變進(jìn)一步保護(hù)腎臟。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9
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本文編號(hào)：1756748