發(fā)布時間：2018-04-13 17:27

  本文選題：熱射病 + 中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥　； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景和意義熱射病(heat stroke:HS),即重癥中暑,是一種常見的急癥。主要表現(xiàn)為體溫急劇升高,超過40℃,皮膚出現(xiàn)干燥和灼熱,伴有明顯中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀。重癥患者若未能及時有效控制,則迅速發(fā)展為全身多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),死亡率可達30-50%。近年來,因全球氣候變暖,我國軍人在熱區(qū)進行訓練、野戰(zhàn)演習和執(zhí)行任務時中暑的發(fā)生率明顯增加,往往由于部隊訓練及執(zhí)行任務的地區(qū)條件較艱苦,醫(yī)療水平較為落后,故死亡率更高。因此研究熱射病發(fā)生機理,探索新的治療策略和措施,提高熱射病的救治成功率,對維護軍人以及特殊職業(yè)人群的身體健康,保障部隊的戰(zhàn)斗力具有重要的作用和意義。熱射病的急性期中樞神經(jīng)損害為其主要癥狀表現(xiàn),也是診斷熱射病的主要依據(jù)。有關熱射病中樞神經(jīng)損傷的機理目前已有較多文獻報道,研究表明熱射病時高溫對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生直接損傷作用,可造成腦細胞發(fā)生一系列病理生理效應。還有研究認為熱射病時腦損傷的主要病理生理基礎是腦缺血、缺氧,可導致中樞神經(jīng)細胞繼發(fā)性損傷。然而,除了高熱,以及缺血、缺氧等因素外,在熱射病的發(fā)生發(fā)展中,中樞神經(jīng)炎癥反應也具有重要的作用。熱射病患者的很多臨床資料研究結(jié)果提示腦組織發(fā)生了明顯炎癥反應。利用熱射病動物模型,很多研究者發(fā)現(xiàn)熱射病可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)促炎因子IL-1、IL-6等大量生成,炎癥因子的升高與神經(jīng)系統(tǒng)的損傷、血管水腫以及神經(jīng)元死亡有明顯相關性。但是,關于熱射病過程中中樞神經(jīng)炎癥反應發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸的主要機制目前還缺乏深入認識,因此也導致臨床救治熱射病過程中沒有充分認識中樞神經(jīng)炎癥的重要性。中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應的發(fā)生及發(fā)展與小膠質(zhì)細胞密切相關。小膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起到營養(yǎng)、支持、抗原遞呈和組織修護等作用,也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應的主要介質(zhì),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理和生理過程中起到至關重要的作用。小膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中具有雙重作用。一方面小膠質(zhì)細胞具有抗炎作用,可通過吞噬細胞碎片、釋放抗炎因子以及神經(jīng)生長因子來減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷,并促進組織恢復。另一方面小膠質(zhì)細胞活化可釋放高水平的細胞毒性物質(zhì)和促炎因子,造成神經(jīng)元失能和神經(jīng)細胞死亡。近年來研究明確小膠質(zhì)細胞這種雙重作用主要和小膠質(zhì)細胞激活后的活化表型有關,當中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到各種病理刺激時小膠質(zhì)細胞迅速發(fā)生活化,活化后小膠質(zhì)細胞主要表現(xiàn)為兩種不同活化表型:M1活化表型與M2活化表型。M1型活化的小膠質(zhì)細胞主要分泌促炎因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、NO等,發(fā)揮促進炎癥反應、抑制吞噬功能等神經(jīng)毒性作用。M2型活化的小膠質(zhì)細胞主要分泌抑炎因子IL-4、IL-10、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、精氨酸酶(Arg1)以及神經(jīng)營養(yǎng)因子等,主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥、維持吞噬、促進修復和再生等神經(jīng)保護作用。由此,我們推測熱射病過程中中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應的發(fā)生發(fā)展與小膠質(zhì)細胞激活后呈現(xiàn)不同的活化表型相關。因此,本課題通過建立小鼠熱射病模型,觀察小膠質(zhì)細胞在熱射病小鼠早期中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥發(fā)生的變化,研究熱射病小鼠腦組織中小膠質(zhì)細胞活化表型的變化情況,并采用離體細胞模型初步探討熱射病過程中影響小膠質(zhì)細胞活化表型變化的因素,以揭示小膠質(zhì)細胞在熱射病中導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應中的作用,為以后臨床上通過采用調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞活化來救治熱射病提供實驗室依據(jù)。研究方法1、采用12周齡的BALB/c 12健康雄性小鼠,重量為(29.1±0.6)g,小鼠置于高溫環(huán)境智能模擬實驗艙,溫度(41.2±0.5)℃,相對濕度(60±2)%,加熱至直腸溫度達到(42.4±0.2)℃建立熱射病小鼠模型。將小鼠隨機分為正常對照組(CON),熱射病組(HS),熱射病組又分為熱射病1 h組(HS-1h)、熱射病3 h組(HS-3h)、熱射病6 h組(HS-6h)、熱射病12 h組(HS-12h)、熱射病24 h組(HS-24h)。對比觀察艙室內(nèi)及出艙后Tre變化和生存率情況,以及不同熱射病組小鼠體質(zhì)量的變化,利用HE染色觀察大腦組織病理變化。通過實時定量熒光PCR(quantitative real-timePCR,q PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測各組小鼠大腦皮層及海馬TNF-α、IL-1β和IL-6基因及蛋白表達,探討熱射病后各恢復時相點大腦炎癥的變化情況。2、通過qPCR檢測各組小鼠大腦皮層M1極性活化標志物CD45、CD16和CD11bm RNA和M2極性活化標志物Arg1(Arginase 1,精氨酸酶)、FIZZ(found in inflammatory zone,發(fā)現(xiàn)于炎癥區(qū)域)和CD206 m RNA的相對表達水平。Western Blot檢測各組小鼠大腦皮層M1極性活化標志物蛋白CD45、CD11b和M2極性活化標志物蛋白FIZZ、CD206的表達水平。免疫組織熒光觀察M1極性活化標志物CD45和M2極性活化標志物CD206表達情況,探討熱射病后不同時間點大腦皮層小膠質(zhì)細胞活化表型的表達規(guī)律。3、通過體外培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細胞以及BV-2與PC12神經(jīng)細胞transwell共培養(yǎng)的細胞模型,采用熱應激及脂多糖(LPS)刺激,采用ELSA檢測各種條件下培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α、IL-1β的濃度,明確熱應激后小膠質(zhì)細胞促炎反應的規(guī)律。用q-PCR、流式細胞術以及免疫組織熒光標記觀察各種條件和刺激模型中BV-2小膠質(zhì)細胞M1極性活化標志物CD11b、CD45和M2極性活化標志物FIZZ、CD206 m RNA、蛋白質(zhì)表達量在不同時間點的相對表達水平揭示熱應激及LPS對單獨或共培養(yǎng)條件下BV-2小膠質(zhì)細胞活化表型的影響,初步探討對熱射病過程中觸發(fā)小膠質(zhì)細胞活化的主要機制。結(jié)果1、在(41.2±0.5)℃、濕度(60±2)%環(huán)境中持續(xù)暴露至小鼠Tre達(42.4±0.2)℃建立了小鼠熱射病模型。出艙后HS-1h組小鼠Tre體溫明顯降低,表現(xiàn)為低體溫期,HS-24h組小鼠Tre略高于CON組,表現(xiàn)為發(fā)熱期;HE染色觀察到在熱射病后恢復1h小鼠觀察到細胞周圍水腫、血管周圍水腫、細胞核固縮裂解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紊亂等,其后隨時間延長損傷程度逐步減輕。表明熱應激導致小鼠中樞神經(jīng)細胞出現(xiàn)明顯病理變化,熱射病中樞神經(jīng)損傷小鼠模型成功建立。HS-1h組、HS-3h組小鼠大腦皮層和海馬炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表達及蛋白合成明顯增多,與CON組比較差異明顯(P0.0001),HS-24h組小鼠大腦皮層和海馬炎癥因子與CON組無明顯差異(P0.05)。提示熱射病恢復期內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯炎癥反應,以恢復期1h最為嚴重,到24h后基本恢復正常水平。2、熱射病小鼠大腦皮層M1極性活化標志物CD45、CD16和CD11b的m RNA表達水平在熱射病恢復后1 h迅速升高(P0.01),到24 h后m RNA表達水平基本恢復至CON組水平(P0.05)。小鼠大腦皮層M2極性活化標志物Arg1、FIZZ和CD206的m RNA表達水平在熱射病恢復3h開始明顯增加(P0.001),后隨時間延長逐漸升高,到24h后達到最高(P0.0001)。皮層M1及M2極性活化標志物蛋白表達水平基本與m RNA表達的變化規(guī)律相似。免疫組織熒光觀察M1極性活化標志物CD45,熱射病后恢復1h標記明顯,M2極性活化標志物CD206在熱射病后恢復24h標記明顯。3、熱應激刺激BV-2小膠質(zhì)細胞后,檢測到到炎癥因子TNF-α、IL-1β含量明顯升高(P0.0001),后逐漸降低,24 h后仍然高于對照組(P0.0001)。熱刺激后1-3h BV-2小膠質(zhì)細胞M1極性活化標志物CD45、CD11b mRNA表達水平顯著高于對照(P0.0001),其后略有下降,24 h仍維持高表達水平(P0.01);而M2標志物CD206、FIZZ mRNA相對表達水平在熱應激后3 h出現(xiàn)表達高峰(P0.01),其它時相組與對照無明顯差異(P0.05)。流式細胞檢測M1及M2標志物CD45與CD206蛋白質(zhì)在熱應激1 h與24 h的表達,結(jié)果基本與mRNA相似。免疫熒光觀察到CD45在恢復1h表達增多,至24 h基本降低至CON組水平,CD206在恢復1 h至24 h基本無明顯變化。BV-2小膠質(zhì)細胞與PC12神經(jīng)細胞transwell共培養(yǎng)的細胞模型,觀察發(fā)現(xiàn)熱應激后小膠質(zhì)細胞M1極化標志物CD45、CD11bmRNA相對表達水平在1 h時表達最高(P0.0001),之后逐漸下降,24 h后與對照無明顯差異(P0.05)。M2極化標志物FIZZ、CD206 m RNA相對表達水平的表達量在在熱應激3-6h開始升高,到24 h達到最高(P0.0001);流式細胞術檢測M1極化標志物CD45與的M2極化標志物CD206蛋白表達量,其變化趨勢與m RNA基本一致。免疫熒光觀察CD45在恢復1 h時少量增加,恢復至24 h時降至CON組水平。CD206在恢復1 h變化不明顯,恢復至24 h增加顯著。LPS刺激后1-3 h BV-2小膠質(zhì)細胞M1極化標志物CD45、CD11bm RNA表達水平明顯升高(P0.0001),24 h后達到峰值(P0.0001);M2極化標志物CD206在刺激后1-12 h變化與對照組比較無明顯差異,M2極化標志物FIZZmRNA相對表達水平在LPS刺激后1-3h變化不明顯,6 h-24 h反而明顯低于對照組。流式細胞術檢測M1極化標志物CD45及M2標志物CD206蛋白質(zhì)在熱應激1 h與24 h的表達,結(jié)果與m RNA表達變化基本相似。免疫熒光觀察到CD45持續(xù)增加,至24 h達到最高。CD206在1 h無明顯變化,至24 h降低。全文結(jié)論1、熱射病后恢復期1h-3h內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)明顯的炎癥反應,病理損傷最重,之后隨著時間延長逐漸減輕,至24h基本趨于恢復,提示中樞神經(jīng)炎癥與熱射病中樞神經(jīng)損傷密切相關。2、熱射病可誘導小鼠腦組織小膠質(zhì)細胞活化,其活化的規(guī)律表現(xiàn)為熱射病后1h-3h主要表現(xiàn)為M1型極化,而在熱射病后24h則主要表現(xiàn)為M2型極化,結(jié)果表明熱射病后小膠質(zhì)細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化這種變化形式可能是熱射病中樞神經(jīng)炎癥發(fā)生發(fā)展的主要原因。3、熱應激可明確激活小膠質(zhì)細胞,并主要表現(xiàn)為M1型極化,而后期小膠質(zhì)細胞活化表型向M2轉(zhuǎn)化則可能和小膠質(zhì)細胞所處微環(huán)境有關,LPS刺激小膠質(zhì)細胞活化表型的變化形式與熱應激刺激并不相同,結(jié)果提示熱射病后中樞神經(jīng)炎癥以及小膠質(zhì)細胞活化表型的變化基本與外周血中LPS無關。
[Abstract]:In recent years , many researchers found that the main pathological physiological basis of heat injection is cerebral ischemia and hypoxia , which can lead to secondary injury of central nervous system . In recent years , microglia cell activation can release high - level cytotoxic substances and pro - inflammatory factors . It is suggested that microglial cells can release high - level cytotoxic substances and pro - inflammatory factors . The expressions of TNF - 偽 , IL - 1尾 and IL - 6 in cerebral cortex and hippocampus of mice were detected by means of real - time quantitative real - time PCR ( PCR ) and enzyme linked immunosorbent assay ( ELISA ) . There was no significant difference between the expressions of TNF - 偽 , IL - 1尾 and IL - 6 in cerebral cortex and hippocampus in HS - 3h group ( P0.05 ) . The expression level of CD206 protein in mouse brain tissue was significantly higher than that of control group . The expression level of CD206 protein in 1 - 3 h BV - 2 microglial cell was significantly higher than that in control group .

【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R594.12

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 吳小坤;李佳;趙娟;鄧暉;;1例熱射病的MRI影像表現(xiàn)[J];中風與神經(jīng)疾病雜志;2013年04期

2 陳壽權;李章平;;中暑及其救治[J];世界急危重病醫(yī)學雜志;2007年05期

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本文編號：1745493