本文選題：干擾素α　切入點：中和抗體　出處：《安徽大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：AIA22是從大容量全合成人單鏈?zhǔn)删w抗體庫中通過高通量固相篩方法獲得的一個抗多亞型IFNα全人源抗體分子,具有有別于臨床在研同靶點抗體(Sifalimumab和AGS-009)的全新抗原表位(IFNAR2結(jié)合表位),能夠有效中和除IFNa-7以外的全部IFNα亞型,具備與臨床在研同靶點抗體完全不同的IFNα亞型中和譜。前期研究證實,AIA22較對照抗體Sifalimumab具有明顯的表位優(yōu)勢,主要體現(xiàn)為AIA22在對IFNα-2b等亞型親和力低于Sifalimumab的情況下表現(xiàn)出明顯優(yōu)于Sifalimumab的中和活性。但是,AIA22對多數(shù)亞型IFNα(IFNa-2b、4b除外)的中和活性不及對照抗體Sifalimumab,提示候選抗體分子AIA22有待進一步改造,以提升其對多個亞型IFNα的中和活性。本研究主要依賴基于結(jié)構(gòu)的抗體體外親和力成熟技術(shù),對AIA22進行定點設(shè)計和改造,并評價其結(jié)合活性、中和活性、穩(wěn)定性、代謝特征等分子特性,最終篩選獲得對多亞型IFNα親和力和中和活性明顯提高的候選抗體分子,整體中和活性達到甚至超過對照抗體Sifalimumab的水平。首先,我們對AIA22輕重鏈CDR區(qū)進行了丙氨酸掃描,并通過ELISA方法鑒定丙氨酸掃描突變體對IFNa-1b和IFNa-2b的結(jié)合活性變化,結(jié)果揭示了抗原抗體相互作用的關(guān)鍵信息,為同源模建和分子對接方法構(gòu)建的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型提供了實驗數(shù)據(jù)支持。基于對復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型的分析,發(fā)現(xiàn)AIA22和IFNa-Ib親和力低的可能原因是AIA22與IFNa-1b相互作用界面存在明顯的結(jié)構(gòu)沖突(重鏈Y99與IFNα-1b的LoopAB區(qū))。結(jié)合丙氨酸掃描的結(jié)果,以改變沖突位點局部構(gòu)象為目的,我們設(shè)計了一系列突變體抗體,ELISA鑒定其結(jié)合活性的變化,同時對結(jié)合活性顯著改善的突變位點進行選擇組合。采用ELISA和forteBio系統(tǒng)就組合突變體對IFNα-1b和IFNα-2b的親和力及動力學(xué)特性進行鑒定,獲得多個對IFNα-1b結(jié)合活性有改善對IFNa-2b結(jié)合活性不降低的突變體抗體。進一步地,對突變體抗體進行體外中和活性的鑒定,并最終獲得對多個IFNa亞型中和活性明顯提高的突變體抗體分子L-S34A+H-32G96W(命名為AIAmut)。相比于親本抗體AIA22, AIAmut對IFNa-1b、2a、2b、4b、5、10、16、17、21的中和活性有不同程度的提高,對IFNα-6、8的中和活性基本保持不變,對IFNa-14中和活性降低明顯。整體而言,AIAmut對IFNα中和活性有明顯的提升。相比于對照抗體Sifalimumab,突變體抗體AIAmut在保證對IFNa-2b中和活性優(yōu)勢的前提下,對IFNα-4b、5、10、16、17、21的中和活性也達到Sifalimumab水平；對IFNα-1b的中和活性已接近Sifalimumab;對IFNα-6,8,14的中和活性與Sifalimumab仍存在較大差距。在基于結(jié)構(gòu)模建進行分子設(shè)計的同時,我們成功結(jié)晶了AIA22-Fab/IFNα-2b復(fù)合物,并解析獲得晶體結(jié)構(gòu)信息。基于復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),以AIAmut為基礎(chǔ),我們設(shè)計了一系列突變體抗體分子。首先,我們構(gòu)建了突變體抗體分子,并利用forteBio系統(tǒng)對突變體進行鑒定,比較突變體抗體分子對IFNα-lb的親和力與結(jié)合特征的變化。對優(yōu)選的突變體抗體分子,進一步檢測其對IFNa-2b的親和力與結(jié)合特征的變化。淘汰對IFNa-2b結(jié)合活性明顯降低的突變體,最終得到W2S1A7、W2A7、W2A10、W2A11、S1A7、S1A10、S1A11、VV3共計8個候選突變體抗體分子。進一步地,我們以表達水平、穩(wěn)定性和中和活性等為評價指標(biāo)對8個候選抗體分子進行優(yōu)選。穩(wěn)定性評價方面,以4℃放置樣品為標(biāo)準(zhǔn)品,分別以重組IFNα-1b-His、IFNα-2b-His和IFNα-4a-His為目標(biāo)抗原,比較分析室溫和37℃條件下于血清和pH6.5 PBS緩沖液中放置的各突變體抗體的結(jié)合活性,進而評價其穩(wěn)定性。結(jié)果表明,除W3和SIA11的結(jié)合活性表現(xiàn)明顯低于其他突變體及AIAmut外,其他突變體穩(wěn)定性均好于AIAmut。考慮W3的表達水平明顯低于其他突變體,直接淘汰W3。同時,結(jié)合各突變體抗體對IFNa-1b和IFNa-2b中和活性的初步評價結(jié)果,優(yōu)選出W2S1A7、W2A7和W2A10三個突變體抗體分子。與AIAmut相比,三個突變體抗體分子對IFNα-1b和FNα-2b的中和活性均有提高,特別是對IFNa-1b的中和活性提升明顯,達到甚至優(yōu)于Sifalimumab的水平。就三個候選抗體分子對各亞型IFNa的中和活性進行全面評價,結(jié)果表明,W2S1A7和W2A7對各亞型IFNa整體(除IFNa-14外)的中和活性提升更為明顯。具體地,W2S1A7和W2A7對IFNα-2b、4a、21的中和活性優(yōu)于Sifalimumab;對IFNα-1b、5、8、10、16、17的中和活性與Sifalimumab相當(dāng)；對IFNa-6的中和活性有明顯提高,但與Sifalimumab相比仍然存在較大差距；對IFNa-7仍無中和活性；相比于AIAmut,突變體抗體分子對IFNa-14的中和活性存在明顯降低。Babl/C小鼠的體內(nèi)的代謝特征評價結(jié)果表明,W2SIA7和W2A7體內(nèi)半衰期均不低于120小時。相比之下,W2S1A7最高血藥濃度及半衰期均優(yōu)于W2A7,因此,我們最終確定W2S1A7為候選抗體藥物分子。
[Abstract]:The results showed that AIA22 and IFNa - 1b had a significant lower affinity than that of the control antibody . The results showed that AIA22 had a significant lower affinity to IFNa - 1b .
On the basis of structural modeling , we have successfully crystallized AIA22 - Fab / IFN偽 - 2b complexes .
The neutralization activity of IFNa - 6 is obviously improved , but there is still a great gap compared with Sifpea ;
the IFNa - 7 still has no neutralizing activity ;
In comparison with AIAmut , there was a significant decrease in the neutralizing activity of the mutant antibody molecule to IFNa - 14 . In the body of Babl / C mice , the half - life of W2SIA7 and W2A7 was not less than 120 hours . In contrast , the highest plasma concentration and half - life of W2S1A7 were better than that of W2A7 , so we finally determined that W2S1A7 was a candidate antibody drug molecule .

【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R593.241

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張麗蘭;;干擾素及其臨床應(yīng)用 三 干擾素-α(interferon alpha,IFN-α)[J];中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志;2007年04期

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本文編號：1723961