發(fā)布時間：2018-03-29 20:08

  本文選題：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎　切入點：佐劑性關(guān)節(jié)炎　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種難治性多系統(tǒng)疾病,已有研究表明,關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性代謝物聚集導(dǎo)致的關(guān)節(jié)液pH值下降可導(dǎo)致軟骨細胞過度凋亡,并最終引起關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)的侵蝕和破壞。細胞焦亡(pyroptosis)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種炎癥性程序性細胞死亡方式,研究發(fā)現(xiàn)細胞焦亡與一些自身免疫性疾病,例如RA的發(fā)生有關(guān),提示細胞焦亡可能參與了RA的發(fā)生發(fā)展過程,但是RA發(fā)生過程中是否存在關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡目前尚不清楚。酸敏感離子通道(acid-sesing ion channels,ASICs)是一類由細胞外質(zhì)子激活的陽離子通道,主要作用是通透Na+和Ca~(2+)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ASIC1a通過上調(diào)關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)[Ca~(2+)]i促使RA患者關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡,而ASIC1a在RA患者關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡過程中的作用有待進一步研究證明�；钚匝踝杂苫�(reactive oxygen species,ROS)是細胞內(nèi)的一種重要信使分子,具有極為重要的生物學(xué)活性,在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。已有研究表明,ROS與細胞內(nèi)[Ca~(2+)]i密切相關(guān)并參與細胞焦亡過程,但是ROS在ASIC1a介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡中的作用目前尚不清楚。本課題通過體內(nèi)體外兩方面實驗研究佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis,AA)大鼠是否存在關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡,同時觀察ASIC1a在此過程中的作用及其可能機制。本課題主要包括以下四個方面:1.體內(nèi)實驗觀察AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡過程,以及ASIC1a在細胞焦亡過程中的作用。Sprague Dawley大鼠40只,隨機分為正常組、AA模型組、AA模型+陽性藥阿司匹林(50mg/kg)組、AA模型+ASIC1a阻斷劑阿米洛利(100mg/kg)組。所有大鼠于造模后第28天處死,收集大鼠血漿、脾臟、膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)。結(jié)果表明,弗氏完全佐劑可誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡,阻斷ASIC1a可以顯著抑制AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡。具體表現(xiàn)為:阻斷ASIC1a可以抑制AA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜增生,關(guān)節(jié)軟骨侵蝕和破壞,以及多種炎癥細胞的浸潤,并可以抑制aa大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨ii型膠原(collagenii,col2a)蛋白在關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中的降解;阻斷asic1a可以抑制aa大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨apoptosis-associatedspeck-likeprotein(asc),caspase-1,nod-likereceptorprotein3(nlrp3),蛋白多糖(aggrecan,agg),col2a,asic1a,il-1β,il-18的表達,阿司匹林也表現(xiàn)出類似的抑制關(guān)節(jié)炎炎癥和關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡的效果。以上結(jié)果提示:aa大鼠存在關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡,阻斷asic1a可以顯著抑制aa大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡。2.體外實驗觀察胞外酸化處理對原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡的影響。原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞按照如下分組:(1)ph7.4正常組、ph7.0酸化組、ph6.5酸化組和ph6.0酸化組,各組細胞分別用相應(yīng)ph值的含1%fbs的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。(2)ph7.4正常組、ph6.0酸化6h組、酸化12h組、酸化24h組和酸化48h組,酸化處理相應(yīng)時間后收集細胞和培養(yǎng)基上清液。(3)ph7.4正常組、ph6.0酸化組、ph6.0+caspase-1特異性抑制劑ac-yvad-cho(10μm)處理組,細胞接受相應(yīng)處理后再用ph6.0的培養(yǎng)基處理24h。結(jié)果表明胞外酸化處理24h和48h可以促進原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞asc,caspase-1,nlrp3,asic1a,il-1β,il-18的表達,同時胞外酸化處理也可以上調(diào)細胞培養(yǎng)上清液中的乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,ldh)水平以及細胞內(nèi)ros水平。此外用ac-yvad-cho抑制caspase-1表達可以抑制胞外酸化處理誘導(dǎo)的上述蛋白和基因的表達。以上結(jié)果提示:胞外酸化處理可以顯著誘導(dǎo)原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡,并上調(diào)細胞內(nèi)asic1a和ros表達量。3.體外實驗觀察阻斷和沉默asic1a對胞外酸化處理誘導(dǎo)的原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡的影響。原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞按照如下分組:ph7.4正常組、ph6.0酸化組、ph6.0+asic1a沉默組、ph6.0+空質(zhì)粒對照組以及ph6.0+asic1a特異性抑制劑pctx-1(100ng/ml)組,細胞接受相應(yīng)處理后再用ph6.0的培養(yǎng)基處理24h。結(jié)果表明基因和蛋白上抑制asic1a可以顯著抑制胞外酸化處理誘導(dǎo)的原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞ASC,Caspase-1,NLRP3,ASIC1a,IL-1β,IL-18的表達,以及細胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平。同時發(fā)現(xiàn)Pctx-1可以顯著下調(diào)細胞內(nèi)[Ca~(2+)]i和ROS水平。以上結(jié)果提示:阻斷ASIC1a抑制胞外酸化處理誘導(dǎo)的原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡,此過程可能與其參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)[Ca~(2+)]i和ROS水平有關(guān)。4.體外實驗觀察Ca~(2+)、ROS對ASIC1a介導(dǎo)的酸化誘導(dǎo)的原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡的影響。原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞按照如下分組:pH7.4正常組、pH6.0酸化組、pH6.0+Ca~(2+)螯合劑BAPTA-AM(10μM)處理組、pH6.0+ROS還原劑NAC(10mmol/L)處理組,細胞接受相應(yīng)處理后再用pH6.0的培養(yǎng)基處理24h。結(jié)果表明BAPTA-AM可以顯著抑制胞外酸化誘導(dǎo)的原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞ASC,Caspase-1,NLRP3,ASIC1a,IL-1β,IL-18的表達,以及細胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平和細胞內(nèi)ROS水平;ROS還原劑NAC也可以顯著抑制胞外酸化處理誘導(dǎo)的上述蛋白和基因的表達。以上結(jié)果提示:細胞內(nèi)Ca~(2+)超載引起的細胞內(nèi)ROS表達上調(diào)參與了ASIC1a介導(dǎo)的胞外酸化誘導(dǎo)的原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的焦亡過程。綜上所述,本研究結(jié)果提示:AA發(fā)生過程中以及胞外酸化處理通過激活關(guān)節(jié)軟骨細胞ASIC1a,調(diào)節(jié)細胞外Ca~(2+)內(nèi)流,引起關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)Ca~(2+)超載,從而引起關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)ROS表達上調(diào),最終誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細胞焦亡,加重關(guān)節(jié)軟骨局部組織的侵蝕破壞和炎癥反應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R593.22

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本文編號：1682648