本文選題：糖尿病周圍神經(jīng)病變　切入點(diǎn)：筋脈通　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2015年博士論文

【摘要】：[目的]從整體、細(xì)胞及分子水平研究炎性因子在糖尿病大鼠周圍神經(jīng)修復(fù)再生中的作用及中藥筋脈通是否能夠通過干預(yù)炎性因子途徑減輕神經(jīng)組織損傷、促進(jìn)神經(jīng)再生修復(fù),從而減少DPN的發(fā)生。[方法]1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常(Con)組和造模組,造模組采用鏈脲佐菌素(60mg/kg)一次性腹腔注射建立糖尿病大鼠模型。造模成功后隨機(jī)分為糖尿病(DM)組、筋脈通(JMT)組、神經(jīng)妥樂平(Ntp)組,每組各10只。成模后予灌胃給藥,JMT和Ntp組分別按成人劑量15倍給藥,Con組和DM組則給予等量蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃16周,測(cè)量大鼠機(jī)械痛閾值,采用免疫組化、ELISA、Western Blot等方法觀察DPN大鼠坐骨神經(jīng)組織中IL-1β、IL-6、IL-10和]TNF-α等炎性因子及NGF、NT-3等神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)以及中藥筋脈通的干預(yù)作用。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用組織貼塊法體外培養(yǎng)乳鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞(SCs),設(shè)置正常對(duì)照組(25mmol/L葡萄糖)及50、75、100mmol/L不同濃度葡萄糖的條件培養(yǎng)基,采用CCK-8法摸索高糖對(duì)SCs的最佳作用時(shí)間和最宜作用濃度：分別加入普通培養(yǎng)基、正常鼠血清培養(yǎng)基、高糖培養(yǎng)基(Glu)、筋脈通(JMT)和神經(jīng)妥樂平(Ntp)含藥血清進(jìn)行培養(yǎng),探索筋脈通含藥血清對(duì)高糖條件下SCs活性的影響；ELISA法檢測(cè)不同干預(yù)條件下SCs上清液中IL-6、TNF-α、NGF的含量；Western Blot法檢測(cè)SCs中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α及NGF、NT-3蛋白的表達(dá)。[結(jié)果]第一部分：1.血糖和體重：與Con組相比,各造模組大鼠血糖均升高(P0.05)。藥物干預(yù)后,治療組血糖在同一時(shí)間點(diǎn)與DM組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),治療組間血糖在各時(shí)間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。造模后各組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。給藥4周后,DM組與Con組相比體重下降(P0.05)：給藥8、12、16周各造模組與Con組相比體重下降(P0.05),各造模組組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2.機(jī)械痛閾值：與Con組相比,DM組的左右足機(jī)械痛閾值均降低(P0.05),糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)模型成功建立。3. ELISA法檢測(cè)DPN大鼠血清中IL-6、TNF-α、NGF的含量：(1) IL-6、TNF-α:與Con組相比,各組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均升高(P0.05)；與DM組相比,JMT組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均降低(P0.05),Ntp組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)：與Ntp組相比,JMT組IL-6、TNF-α含量均降低(P0.05)。(2)NGF：與Con組相比,DM組、JMT組大鼠血清中NGF含量減少(P0.01、P0.05)；與DM組相比,各治療組均升高,差異具有顯著性意義(P0.01); JMT組較Ntp組血清中NGF含量減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4.免疫組化法檢測(cè)DPN大鼠坐骨神經(jīng)中NT-3的表達(dá)：與Con組相比,DM組大鼠坐骨神經(jīng)NT-3的IOD值下降(P0.05)；與DM組相比,JMT組、Ntp組大鼠坐骨神經(jīng)NT-3的IOD值升高(P0.05); JMT組與Ntp組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5. Western Blot檢測(cè)坐骨神經(jīng)IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、 NGF、NT-3蛋白的表達(dá)：(1) IL-1β、IL-10:與Con組相比,DM組IL-1β、IL-10蛋白表達(dá)增加(P0.05)：與DM組相比,JMT組IL-1β、IL-10蛋白表達(dá)減少(P0.05);JMT組與Ntp組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(2)IL-6：各組IL-6蛋白表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；(3) TNF-α:與Con組相比,DM組TNF-α蛋白表達(dá)增加(P0.05)；與DM組相比,JMT組、Ntp組TNF-α蛋白表達(dá)減少(P0.05); JMT組與Ntp組TNF-a蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)(4)NGF：與Con組相比,DM組NGF蛋白表達(dá)減少(P0.05)；與DM組相比,JMT組NGF蛋白表達(dá)增加(P0.05)；與Ntp組相比,JMT組NGF蛋白表達(dá)增加(P0.05)。(5)NT-3：與Con組相比,DM組NT-3蛋白表達(dá)減少(P0.05)；與DM組相比,JMT組NT-3蛋白表達(dá)增加(P0.05); JMT組與Ntp組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。第二部分：1.成功培養(yǎng)乳鼠坐骨神經(jīng)SCs,經(jīng)鑒定純度可達(dá)90%以上。2.CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞活性：(1)糖濃度的選擇：隨培養(yǎng)時(shí)間的延長,各濃度葡萄糖組對(duì)SCs活性的抑制作用最早于48h時(shí)產(chǎn)生,50mM Glu組、75mM Glu組、100mM Glu組均表現(xiàn)出較為明顯的抑制作用,故選擇48h、50mMGlu作為最佳作用時(shí)間和最適糖濃度。(2)筋脈通含藥血清對(duì)高糖條件下SCs活性的影響：與正常對(duì)照組相比,正常鼠血清組、JMT組的細(xì)胞相對(duì)活性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),50mM Glu組細(xì)胞相對(duì)活性下降(P0.01),Ntp組細(xì)胞相對(duì)活性亦有所下降(P0.05)：與50mMGlu組比較,JMT組細(xì)胞相對(duì)活性升高(P0.01),Ntp組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；與Ntp組相比,JMT組細(xì)胞相對(duì)活性升高(P0.01)。3.ELISA法檢測(cè)SCs上清液中IL-6、TNF-α、NGF的含量：(1)IL-6：各組SCs上清液中IL-6含量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；(2) TNF-α:與Con組相比,Glu組SCs.上清液中TNF-α含量增加(P0.05)；與Glu組相比,JMT組SCs上清液中TNF-α含量降低(P0.05)；與Ntp組相比,JMT組SCs上清液中TNF-α含量降低(P0.05)。(3)NGF：與Con組相比,Glu組SCs上清液中NGF含量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；與Glu組相比,JMT組與Ntp組SCs上清液中NGF含量均升高(P0.05)。4.Western Blot檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、 NGF、 NT-3蛋白表達(dá)：(1)IL-1β：與Con組相比,Glu組IL-1β蛋白表達(dá)增加(P0.05);與Glu組相比,JMT組IL-1β蛋白表達(dá)減少(P0.01)；與Ntp組相比,JMT組IL-1β蛋白表達(dá)減少(P0.05)(2)IL-6：各組IL-6蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；(3)IL-10：與Con組相比,Glu組、Ntp組IL-10蛋白表達(dá)增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01,P0.05)；與Glu組相比,JMT組IL-10蛋白表達(dá)減少(P0.01)；與Ntp組相比,JMT組IL-10蛋白表達(dá)減少(P0.01)(4) TNF-α:與Con組相比,Glu組TNF-α蛋白表達(dá)增加(P0.05)；與Glu組相比,JMT組TNF-α蛋白表達(dá)減少(P0.05)；JMT組與Ntp組TNF-α蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)(5)NGF：與Con組相比,Glu組、Ntp組NGF蛋白表達(dá)降低(P0.01)；與Glu組相比,JMT組NGF蛋白表達(dá)增加(P0.05)；與Ntp組相比,JMT組NGF蛋白表達(dá)增加(P0.05)(6)NT-3：與Con組相比,Glu組NT-3蛋白表達(dá)減少(P0.05)：與Glu組相比,JMT組NT-3蛋白表達(dá)增加(P0.05);JMT組與Ntp組NT-3蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。[結(jié)論]1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(1)一次性腹腔注射STZ (60mg/kg)建立DM大鼠模型,16周測(cè)定DM大鼠機(jī)械痛閾值降低,DPN大鼠模型成功建立；(2)DPN大鼠坐骨神經(jīng)組織中IL-1p、IL-10、TNF-α蛋白表達(dá)及血清中IL-6、TNF-α含量均明顯增加,表明炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子參與了DPN的發(fā)生發(fā)展；(3)中藥筋脈通能夠降低DPN大鼠坐骨神經(jīng)組織中IL-1β、IL-10、TNF-α蛋白表達(dá)及血清中IL-6、TNF-α含量,具有減輕炎癥反應(yīng)的作用；同時(shí)能夠明顯增加坐骨神經(jīng)組織中NGF、NT-3表達(dá)。其中在改善血清中IL-6、TNF-α分泌和增加坐骨神經(jīng)中NGF蛋白表達(dá)方面,作用優(yōu)于Ntp組。(4)筋脈通具有改善DPN大鼠周圍神經(jīng)組織損傷的作用,干預(yù)炎癥反應(yīng)及促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌可能是其發(fā)揮作用的重要途徑之一。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(1)采用組織貼塊法原代培養(yǎng)SD乳鼠坐骨神經(jīng)SCs,純化后經(jīng)S-100蛋白免疫組化鑒定,純度可達(dá)90%以上。(2)高糖(50mmol/L)培養(yǎng)雪旺細(xì)胞48h時(shí),對(duì)其活性具有明顯抑制作用。JMT含藥血清可顯著提高高糖條件下SCs的活性,作用優(yōu)于Ntp組。(3)高糖培養(yǎng)條件下SCs上清液中TNF-α含量及SCs中IL-1β、IL-10、 TNF-α蛋白表達(dá)均有所增加,提示高糖刺激了SCs產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和炎癥因子；(4)中藥筋脈通能夠降低SCs上清液中TNF-α含量及SCs中IL-1β、 IL-10、TNF-α蛋白表達(dá)；同時(shí)能夠明顯增加SCs中NGF、NT-3表達(dá)。其中在改善SCs上清液中TNF-α分泌、減少SCs中IL-1p及IL-10蛋白表達(dá)和增加SCs中NGF蛋白表達(dá)方面,優(yōu)于Ntp組。[創(chuàng)新點(diǎn)]目前,炎癥因子在糖尿病周圍神經(jīng)病變中所發(fā)揮的具體作用尚不甚明了,本研究擬從整體、細(xì)胞及分子生物學(xué)水平研究炎性因子對(duì)周圍神經(jīng)病變修復(fù)再生的作用及中藥筋脈通是否能夠通過影響炎性因子的途徑減輕神經(jīng)組織損傷,促進(jìn)神經(jīng)再生修復(fù)以減少DPN的發(fā)生,具有一定創(chuàng)新性。[目的] 研究中藥筋脈通對(duì)于糖尿病(DM)大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響。[方法]采用鏈脲佐菌素(STZ) 60mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射的方法制造DM大鼠模型,隨機(jī)分為模型組,筋脈通小、中、大劑量組和維生素C組。所有實(shí)驗(yàn)大鼠灌胃16周處死,分離DRG,采用尼氏染色觀察DRG形態(tài)學(xué)變化,免疫組織化學(xué)法和qRT-PCR法檢測(cè)大鼠DRG中NADPH氧化酶p22-phox亞基、Cyt C、Bcl-2及Caspase-3的表達(dá),TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。[結(jié)果] 與模型組相比,各治療組的NADPH氧化酶p22-phox亞基蛋白表達(dá)、Cyt C蛋白表達(dá)、Caspase-3 mRNA及其蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率均顯著降低,而Bcl-2mRNA及其蛋白表達(dá)顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或P0.01)；且作用呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性,其中,以筋脈通大劑量組作用最佳,與維生素C組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。[結(jié)論] 中藥筋脈通可防治DPN大鼠周圍神經(jīng)組織損傷,抑制氧化應(yīng)激、減少細(xì)胞凋亡是其作用的重要途徑之一。大劑量筋脈通療效最佳,其作用優(yōu)于維生素C。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 黃文智;梁曉春;王普艷;趙麗;李伯武;張彥東;;筋脈通對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)AGEs及其受體表達(dá)的影響[J];中華中醫(yī)藥雜志;2011年04期

2 劉珊;史霖;王軍陽;范桂香;袁育康;;白介素2在小鼠分支選擇損傷神經(jīng)源性疼痛模型中的鎮(zhèn)痛作用[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年08期

3 曾江正,董克禮,李廣誠,李良明;消渴靈濃縮液對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)IGF-1 mRNA表達(dá)的影響[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年01期

4 葉仁群;陳澤奇;林國彬;李玉紅;賀鈺磊;凌江紅;申定珠;;�；撬嵋种铺悄虿〈笫笞巧窠�(jīng)雪旺細(xì)胞凋亡[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2007年12期

5 孫曉宇;;雪旺細(xì)胞對(duì)于周圍神經(jīng)再生的功能與作用[J];內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年01期

6 周怡昆;薛耀明;;高糖通過高滲透壓改變PAX3基因表達(dá)抑制RSC96雪旺細(xì)胞增殖[J];昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年04期

7 張?jiān)圃?劉笑迎;孫愛軍;程崢青;王欣;張捷青;;高葡萄糖對(duì)與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞的損傷作用[J];復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年06期

8 吳群勵(lì);梁曉春;張宏;屈嶺;孫連慶;趙麗;顧蓓;;中藥筋脈通含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)雪旺細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響[J];世界中西醫(yī)結(jié)合雜志;2011年06期

9 傅擎宇;熊麗麗;陳澤奇;黃娟;戴幸平;;加味補(bǔ)肝湯對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)VEGF表達(dá)的干預(yù)作用[J];中國中醫(yī)藥科技;2008年06期

10 胡昔權(quán),竇祖林,朱洪翔;神經(jīng)妥樂平對(duì)周圍神經(jīng)損傷的治療作用[J];中國新藥與臨床雜志;2003年02期

，

本文編號(hào)：1674151