本文選題：TXNIP　切入點(diǎn)：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：研究背景:糖尿病(Diabetes Mellitus)已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)成為危害人類身體健康的一大殺手。糖尿病分為胰島素依賴的1型和進(jìn)展較慢、可長(zhǎng)期不依賴胰島素治療的2型,但無論哪種類型糖尿病最終都會(huì)出現(xiàn)β細(xì)胞的損傷和凋亡,并最終導(dǎo)致胰島功能的失代償,而不得不進(jìn)入胰島素依賴期。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在糖尿病大鼠模型和高糖高脂培養(yǎng)的成鼠心肌細(xì)胞中,TXNIP(Trx interacting protein)的表達(dá)顯著增加,同時(shí)心肌細(xì)胞的損傷和凋亡也增加,RNA干擾抑制TXNIP表達(dá)后,細(xì)胞凋亡的發(fā)生顯著減輕,提示TXNIP的高表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前TXNIP已經(jīng)被認(rèn)為是在β細(xì)胞的生理功能和糖尿病的藥物治療上的一個(gè)關(guān)鍵分子。研究表明,在2型糖尿病中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ER stress)參與了β細(xì)胞的凋亡。由于在ER中大量未折疊的蛋白會(huì)激活未折疊蛋白反應(yīng),如果這個(gè)問題一直存在的話就會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過PERK(protein kinase RNA(PKR)-like ER kinase)、IRE1α(inositol-requiring protein-1α)、ATF6α(activating transcription factor 6α)3條通路從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目的:本研究旨在用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù),誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞內(nèi)的TXNIP蛋白高表達(dá),觀察過表達(dá)的TXNIP本身是否可以引起正常糖脂濃度條件下的INS-1細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡,重點(diǎn)研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與了TXNIP誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡的發(fā)生,并對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的下游機(jī)制進(jìn)行分析。方法:(1)實(shí)驗(yàn)分組和腺病毒轉(zhuǎn)染:將在正常糖脂濃度下培養(yǎng)并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的INS-1細(xì)胞分為三組,分別是正常培養(yǎng)(normal)組,空病毒(ad-egfp)組,過表達(dá)(ad-txnip-egfp)組,按照感染復(fù)數(shù)moi=50計(jì)算出轉(zhuǎn)染組需要的病毒量,取各組所需的病毒量分別加入到1ml1640培養(yǎng)基中混勻,加入細(xì)胞中轉(zhuǎn)染,對(duì)照組直接加入1ml1640培養(yǎng)基,4h后補(bǔ)3ml1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);分別于24h,48h換液處理,并于熒光顯微鏡下觀察拍照。(2)觀察轉(zhuǎn)染率:通過對(duì)同一個(gè)視野下帶綠色熒光蛋白的細(xì)胞所占的比例進(jìn)行計(jì)算,分別計(jì)算出ad-egfp組和ad-txnip-egfp組ins-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h、48h的轉(zhuǎn)染率,觀察到48h時(shí)的細(xì)胞存活率和轉(zhuǎn)染效率最高,收集此時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(3)real-timepcr實(shí)時(shí)熒光定量方法測(cè)定病毒轉(zhuǎn)染后ins-1細(xì)胞txnip、atf5、xbp-1mrna的表達(dá)量。(4)westernblot方法測(cè)定病毒轉(zhuǎn)染后,ins-1細(xì)胞txnip、chop、p-perk、perk、atf6、ire1α、p-ire1α、atf5蛋白的表達(dá)。(5)elisa方法檢測(cè)caspase-3、caspase-12的表達(dá)量。(6)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后ins-1細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:1、轉(zhuǎn)染效率的觀察和計(jì)算:如圖2-1-1、2-1-2所示,用熒光顯微鏡觀察并分別計(jì)算出ad-egfp組ins-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h、48h的轉(zhuǎn)染率分別為(12.21±5.58)%、(40.22±3.47)%,ad-txnip-egfp組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h、48h的轉(zhuǎn)染率分別為(12.66±2.80)%、(41.28±3.84)%。由此可以看出無論ad-egfp組或ad-txnip-egfp組48h的轉(zhuǎn)染率均高于24h(p0.01),所以選用48h收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。48h時(shí)ad-egfp組和ad-txnip-egfp組的轉(zhuǎn)染率沒有顯著性差異(p0.05),說明各組轉(zhuǎn)染病毒量達(dá)到一致。2、腺病毒載體構(gòu)建、txnip轉(zhuǎn)染ins-1細(xì)胞成功2.1txnipmrna的表達(dá)量明顯升高圖2-2-1、2-2-2顯示,與正常培養(yǎng)組相比,ad-egfp組ins-1細(xì)胞txnip表達(dá)量沒有顯著性差異(0.73±0.40vs.1.00±0,p0.05);與ad-egfp組相比ad-txnip-egfp組txnip表達(dá)量明顯增高(16.56±2.99vs.0.73±0.40,p0.01),說明病毒載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。2.2txnip蛋白表達(dá)量也明顯增高圖2-3-1、2-3-2中,與正常組相比,ad-egfp組ins-1細(xì)胞txnip蛋白表達(dá)量沒有顯著性差異(0.154±0.029vs.0.156±0.017,p0.05);與ad-egfp組相比ad-txnip-egfp組txnip蛋白表達(dá)量明顯增高(0.527±0.089vs.0.154±0.029,p0.01),進(jìn)一步證實(shí)了病毒載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、目的基因過表達(dá)成功。3、過表達(dá)txnip可以引起ins-1細(xì)胞凋亡增加3.1caspase-3表達(dá)量明顯增高ad-egfp組與對(duì)照組相比,ins-1細(xì)胞caspase-3表達(dá)量沒有明顯差異(0.80±0.18vs.0.68±0.26,單位:μg/ml,p0.05);與ad-egfp組相比ad-txnip-egfp組caspase-3表達(dá)量明顯增高(2.50±0.49vs.0.80±0.18,單位:μg/ml,p0.01),見圖2-4。caspase-3代表了細(xì)胞凋亡的終末途徑,ad-txnip-egfp組caspase-3表達(dá)量增高,說明過表達(dá)txnip可導(dǎo)致ins-1細(xì)胞凋亡增加。3.2流式法檢測(cè)過表達(dá)txnip組ins-1細(xì)胞凋亡率增加ad-egfp組與正常組相比,ins-1細(xì)胞凋亡相對(duì)活性沒有明顯差異(11.77±1.20vs.10.18±1.57,p0.05);與ad-egfp組相比ad-txnip-egfp組ins-1細(xì)胞凋亡率增加(30.79±3.53vs.11.77±1.20,p0.01),如圖2-5-1、2-5-2示,進(jìn)一步驗(yàn)證了過表達(dá)txnip可使ins-1細(xì)胞凋亡增加。4、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了txnip引起的ins-1細(xì)胞凋亡4.1chop蛋白表達(dá)量增高結(jié)果顯示,同正常組相比較,ad-egfp組ins-1細(xì)胞chop蛋白表達(dá)量沒有明顯差異(0.21±0.04vs.0.20±0.03,p0.05);與ad-egfp組相比ad-txnip-egfp組chop蛋白表達(dá)量增高(0.36±0.06vs.0.21±0.04,p0.05),見圖2-6-1、2-6-2。chop是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的一個(gè)重要分子,它在線粒體通路和死亡受體通路中不被激活,所以它能反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路引起的細(xì)胞凋亡,txnip過表達(dá)組chop蛋白表達(dá)量增高,說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路介導(dǎo)了txnip引起的ins-1細(xì)胞凋亡。4.2caspase-12表達(dá)量增高與chop蛋白表達(dá)量變化一致,圖2-7中,ad-egfp組ins-1細(xì)胞caspase-12表達(dá)量沒有明顯差異(0.46±0.07vs.0.46±0.05,單位:1×10-4μg/ml,p0.05);與ad-egfp組相比ad-txnip-egfp組caspase-12表達(dá)量增高(1.35±0.13vs.0.46±0.07,單位:1×10-4μg/ml,p0.05)。caspase-12同chop蛋白一樣,都只是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中被激活,反映了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況,txnip過表達(dá)組caspase-12表達(dá)量增高,進(jìn)一步顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路可以參與txnip引起ins-1細(xì)胞的凋亡。5、atf6α蛋白通路不參與txnip引起的ins-1凋亡ad-egfp組和正常組相比,ad-egfp組ins-1細(xì)胞atf6α蛋白表達(dá)量沒有明顯改變(0.54±0.05vs.0.52±0.08,p0.05),與ad-egfp組相比ad-txnip-egfp組atf6α蛋白表達(dá)量也沒有明顯變化(0.57±0.06vs.0.54±0.05,p0.05)。說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中的atf6α蛋白通路不參與過表達(dá)txnip引起的ins-1細(xì)胞凋亡,圖2-8-1、2-8-2。6、perk蛋白通路可能參與了txnip引起的ins-1凋亡6.1perk蛋白磷酸化升高結(jié)果顯示,圖2-9-1、2-9-2,與正常組相比,ad-egfp組ins-1細(xì)胞p-perk/perk沒有明顯改變(0.51±0.12vs.0.51±0.11,p0.05),與ad-egfp組相比ad-txnip-egfp組p-perk/perk比值增高(0.73±0.12vs.0.51±0.12,p0.05)。提示perk蛋白通路可能參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的ins-1細(xì)胞凋亡。6.2atf5mrna的表達(dá)量升高圖2-10-1、2-10-2顯示,同正常組相比,ad-egfp組ins-1細(xì)胞atf5mrna沒有明顯改變(0.93±0.26vs.1.00±0,p0.05),與ad-egfp組相比ad-txnip-egfp組atf5mrna增高(1.63±0.22vs.0.93±0.26,p0.05)。atf5是perk通路下游信號(hào)中的一個(gè)重要分子,過表達(dá)組atf5mrna的表達(dá)量升高說明perk-atf5這一通路可能參與了txnip引起的ins-1凋亡。6.3atf5蛋白的表達(dá)量也升高圖2-11-1、2-11-2中可以看出,與正常組比,Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞ATF5 mRNA沒有明顯改變(0.50±0.05 vs.0.48±0.04,P0.05),與Ad-eGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組ATF5 m RNA增高(0.68±0.11 vs.0.50±0.05,P0.05)。進(jìn)一步說明了PERK-ATF5這一通路參與了TXNIP使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的的INS-1凋亡。7、IRE1α蛋白通路不參與TXNIP引起的INS-1凋亡7.1 IRE1α蛋白磷酸化變化不明顯Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞p-IRE1α/IRE1α沒有明顯改變(1.90±0.28 vs.1.92±0.29,P0.05),與Ad-eGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組p-IRE1α/IRE1α也沒有明顯變化(1.94±0.30 vs.1.90±0.28,P0.05),見圖2-12-1、2-12-2。說明IRE1α蛋白通路可能不參與過表達(dá)TXNIP使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡。7.2 sXBP-1 mRNA變化不明顯XBP-1是IRE1α通路下游的一個(gè)重要分子,從圖2-13-1、2-13-2可以看出,與正常組相比,Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞sXBP-1 mRNA沒有明顯改變(0.96±0.17 vs.1.00±0,P0.05),與Ad-eGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組sXBP-1 mRNA變化不明顯(1.00±0.17vs.0.96±0.17,P0.05)。剪接后的sXBP-1 mRNA沒有明顯變化,提示IRE1α對(duì)XBP-1的內(nèi)切酶活性并沒有變化,進(jìn)一步說明了TXNIP過表達(dá)中IRE1α蛋白通路不參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡。結(jié)論:(1)單純過表達(dá)TXNIP可以引起正常糖脂濃度培養(yǎng)下的INS-1細(xì)胞凋亡。(2)引起細(xì)胞程序性死亡的三條通路中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路可以參與TXNIP引起的INS-1細(xì)胞凋亡。(3)在TXNIP通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡的三條蛋白通路中,PERK通路參與了這一過程,其余兩條ATF6α通路和IRE1α通路沒有參與。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.1

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10 賈瓊瓊;MicroRNA-214對(duì)H_2O_2損傷L6骨骼肌成肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1659220