本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：自噬　出處：《中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2015年碩士論文

【摘要】：目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)對(duì)長(zhǎng)期高糖損傷的p細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制。方法：體外實(shí)驗(yàn),大鼠胰島素瘤細(xì)胞(INS-1)在高糖(33.3 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)基中處理48小時(shí),之后與BM-MSCs或大鼠成纖維細(xì)胞(208F)共培養(yǎng)12小時(shí),再進(jìn)行下列檢測(cè)：(1)由細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK8)檢測(cè)INS-1細(xì)胞活性;(2)膜連蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/ Propidium iodine)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;(3)放射免疫法(Ratio Immunity Assay, RIA)檢測(cè)INS-1細(xì)胞的胰島素分泌情況；(4)免疫印記法(western blotting)檢測(cè)裂解的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase 3)和兩種常用的自噬標(biāo)記物的表達(dá),分別為Beclinl及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3);(5)綠色熒光蛋白標(biāo)記的LC3 (green fluorescent protein labelled-LC3, GFP-LC3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至INS-1細(xì)胞以量化自噬;(6)應(yīng)用免疫熒光法及透射電鏡(transmission electronic microscope, TEM)分別檢測(cè)INS-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化;(7)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)INS-1細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)及活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成量的變化。另外,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,我們將BM-MSCs輸注到經(jīng)高脂喂養(yǎng)及小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠中。監(jiān)測(cè)大鼠血糖、胰島素及C-肽水平的變化。通過(guò)組織學(xué)染色、免疫熒光法及透射電鏡觀(guān)察大鼠胰島及β細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果：長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境下的INS-1細(xì)胞,其細(xì)胞活性下降、細(xì)胞凋亡率增加、基礎(chǔ)胰島素分泌(basal insulin secretion, BIS)與葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion, GSIS)均受損。BM-MSCs共培養(yǎng)有效減輕了長(zhǎng)期高糖造成的這些損傷,而208F細(xì)胞共培養(yǎng)則無(wú)明顯效應(yīng)。與此同時(shí),western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在與BM-MSCs共培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞中,Beclinl和LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯增加。免疫熒光染色及透射電鏡觀(guān)察的結(jié)果也說(shuō)明BM-MSCs促進(jìn)了高糖環(huán)境下INS-1細(xì)胞中自噬體與自噬溶酶體的形成。但是,抑制自噬明顯削弱了BM-MSCs對(duì)長(zhǎng)期高糖損傷的β細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng),這就意味著B(niǎo)M-MSCs在一定程度上是通過(guò)增強(qiáng)自噬改善了高糖環(huán)境下p細(xì)胞的功能與存活。而且,與僅受到高糖處理的INS-1細(xì)胞相比,BM-MSCs改善了高糖環(huán)境下INS-1細(xì)胞中線(xiàn)粒體的功能,具體表現(xiàn)為MMP的恢復(fù)及細(xì)胞內(nèi)ROS水平的下降,這在很大程度上是由于自噬清除了受損的線(xiàn)粒體。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),輸注BM-MSCs不僅能降低2型糖尿病大鼠血糖,還促進(jìn)了胰島及β細(xì)胞的修復(fù)。更重要的是,結(jié)果顯示輸注BM-MSCs使2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞中溶酶體相關(guān)酶蛋白2(lysosome-associated membrane protein 2, LAMP2)表達(dá)增加、自噬體及自噬溶酶體形成增多,同時(shí)伴隨著β細(xì)胞凋亡減少及胰島素顆粒數(shù)量的增加。結(jié)論：(1)與BM-MSCs共培養(yǎng)后可增強(qiáng)INS-1細(xì)胞自噬,從而保護(hù)INS-1細(xì)胞免受長(zhǎng)期高糖引起的損傷。(2)輸注BM-MSCs亦可通過(guò)調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)2型糖尿病大鼠胰島p細(xì)胞的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)使我們對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的治療機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí),也為臨床應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞治療2型糖尿病提供了重要的理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R587.1

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