本文關鍵詞：MicroRNA-126對人肝細胞糖代謝影響的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《鄭州大學》 2015年

MicroRNA-126對人肝細胞糖代謝影響的機制研究

胡志為  

【摘要】：背景隨著生活節(jié)奏的加快,生活水平的提高,在人們的生活方式發(fā)生巨大變化的同時,代謝性疾病的發(fā)病率也在全世界范圍內逐年攀升,其中糖尿病是代謝性疾病中最常見的一種。在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中,肝臟、肌肉、脂肪等組織對胰島素反應能力下降甚至抵抗胰島素的作用,繼而會引起一些如肥胖、多囊卵巢綜合癥、高脂血癥及動脈粥樣硬化等疾病。肝臟是糖代謝的重要器官,胰島素主要通過胰島素受體底物(IRS)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號傳導通路影響肝臟的糖代謝,然而肝臟胰島素抵抗的發(fā)病機制,目前仍不明確。Micro RNAs(mi RNAs)是一類短小的、非編碼的微小RNAs,對維持機體自身穩(wěn)態(tài)的平衡、疾病的產生和發(fā)展過程中有著重要影響,它們與靶信使RNA(m RNA)的3’非翻譯區(qū)(3’-UTRs)結合,抑制編碼蛋白基因的轉錄后表達。Micro RNA-126不僅在內皮細胞中含量豐富,在凋亡小體中的表達也很高,國內外的研究發(fā)現,在糖尿病動物模型以及在糖尿病患者的血漿中,Micro RNA-126的表達量明顯降低,因此我們認為Micro RNA-126可能與糖尿病的發(fā)生與發(fā)展有聯系。Regazzi等人提出Micro RNAs不僅可以作為早期疾病發(fā)生的標志物,而且還可以是細胞間傳遞信息的信使,導致疾病進展的原因,本實驗將對Micro RNA-126對肝細胞糖代謝影響的機制進行研究。目的本研究通過對來源于肝臟的永生非腫瘤細胞系——張氏肝細胞轉染Micro RNA-126類似物、抑制物及其陰性對照序列,改變細胞內Micro RNA-126的表達量,并測定轉染后細胞內胰島素信號傳導通路中相關蛋白(IRS-1、PIK3R2、Akt-2、p-Akt-2)的表達水平,旨在探討Micro RNA-126對人肝細胞糖代謝功能影響的機制。材料和方法1.用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)張氏肝細胞(Chang liver cell),置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.熒光顯微鏡下確定細胞的最佳轉染條件:取對數生長期的張氏肝細胞以5×105/孔接種于24孔板中,細胞密度生長至70%時,用脂質體Lipofectamine2000轉染不同濃度(20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L)的熒光標記的陰性對照序列(FAM-NC及inhibitor FAM-NC),6小時后在熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光強度,確定細胞最佳轉染濃度。3.將研究對象分為6組:Micro RNA-126類似物組、Micro RNA-126抑制物組、Micro RNA-126類似物陰性對照組、Micro RNA-126抑制物陰性對照組、轉染試劑組和正常對照組。用脂質體Lipofectamine2000將人工合成核苷酸序列(Micro RNA-126類似物、Micro RNA-126抑制物、Micro RNA-126類似物陰性對照物、Micro RNA-126抑制物陰性對照物)分別轉染至相應組細胞中,運用實時熒光定量PCR法(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)檢測細胞中Micro RNA-126的相對表達量。4.運用Western blot法檢測不同轉染組細胞內胰島素受體底物-1(IRS-1)、磷脂酰肌醇激酶p85β(PIK3R2)、蛋白激酶B-2(Akt-2)、磷酸化Akt-2(p-Akt-2)的蛋白表達水平。5.數據統(tǒng)計學的分析由SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行,數據結果由均數±標準差(x±s)表示,數據進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗,并用單因素方差分析(one-way ANOVA)及t檢驗行數據統(tǒng)計學分析,當P0.05時表示數據之間的差異具有統(tǒng)計學意義。結果1.在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現,FAM-NC及inhibitor FAM-NC可以有效的轉染張氏肝細胞,并且呈現濃度依賴性,80 nmol/L為最佳轉染濃度。2.在Micro RNA-126類似物組中,細胞內Micro RNA-126的相對表達量較正常對照組顯著增加(P0.05);其他組細胞中Micro RNA-126的相對表達量與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。3.在Micro RNA-126類似物組細胞中IRS-1、PIK3R2的相對表達量較正常對照組明顯減少,其差異有統(tǒng)計學意義(均P0.05),其余各組細胞中IRS-1、PIK3R2的相對表達量間的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Micro RNA-126類似物組細胞Akt-2的磷酸化水平(p-Akt-2/Akt-2)較正常對照組明顯降低(P0.05),其余各組中p-Akt-2/Akt-2較正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)結論Micro RNA-126通過作用于IRS-1/PIK3R2/Akt-2胰島素信號傳導通路影響肝細胞的糖代謝功能。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1
【目錄】：

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本文編號：164200