本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-126對(duì)人肝細(xì)胞糖代謝影響的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《鄭州大學(xué)》 2015年

MicroRNA-126對(duì)人肝細(xì)胞糖代謝影響的機(jī)制研究

胡志為  

【摘要】：背景隨著生活節(jié)奏的加快,生活水平的提高,在人們的生活方式發(fā)生巨大變化的同時(shí),代謝性疾病的發(fā)病率也在全世界范圍內(nèi)逐年攀升,其中糖尿病是代謝性疾病中最常見(jiàn)的一種。在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,肝臟、肌肉、脂肪等組織對(duì)胰島素反應(yīng)能力下降甚至抵抗胰島素的作用,繼而會(huì)引起一些如肥胖、多囊卵巢綜合癥、高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。肝臟是糖代謝的重要器官,胰島素主要通過(guò)胰島素受體底物(IRS)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)傳導(dǎo)通路影響肝臟的糖代謝,然而肝臟胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制,目前仍不明確。Micro RNAs(mi RNAs)是一類短小的、非編碼的微小RNAs,對(duì)維持機(jī)體自身穩(wěn)態(tài)的平衡、疾病的產(chǎn)生和發(fā)展過(guò)程中有著重要影響,它們與靶信使RNA(m RNA)的3’非翻譯區(qū)(3’-UTRs)結(jié)合,抑制編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。Micro RNA-126不僅在內(nèi)皮細(xì)胞中含量豐富,在凋亡小體中的表達(dá)也很高,國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn),在糖尿病動(dòng)物模型以及在糖尿病患者的血漿中,Micro RNA-126的表達(dá)量明顯降低,因此我們認(rèn)為Micro RNA-126可能與糖尿病的發(fā)生與發(fā)展有聯(lián)系。Regazzi等人提出Micro RNAs不僅可以作為早期疾病發(fā)生的標(biāo)志物,而且還可以是細(xì)胞間傳遞信息的信使,導(dǎo)致疾病進(jìn)展的原因,本實(shí)驗(yàn)將對(duì)Micro RNA-126對(duì)肝細(xì)胞糖代謝影響的機(jī)制進(jìn)行研究。目的本研究通過(guò)對(duì)來(lái)源于肝臟的永生非腫瘤細(xì)胞系——張氏肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染Micro RNA-126類似物、抑制物及其陰性對(duì)照序列,改變細(xì)胞內(nèi)Micro RNA-126的表達(dá)量,并測(cè)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路中相關(guān)蛋白(IRS-1、PIK3R2、Akt-2、p-Akt-2)的表達(dá)水平,旨在探討Micro RNA-126對(duì)人肝細(xì)胞糖代謝功能影響的機(jī)制。材料和方法1.用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)張氏肝細(xì)胞(Chang liver cell),置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.熒光顯微鏡下確定細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的張氏肝細(xì)胞以5×105/孔接種于24孔板中,細(xì)胞密度生長(zhǎng)至70%時(shí),用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染不同濃度(20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L)的熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照序列(FAM-NC及inhibitor FAM-NC),6小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度,確定細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)染濃度。3.將研究對(duì)象分為6組:Micro RNA-126類似物組、Micro RNA-126抑制物組、Micro RNA-126類似物陰性對(duì)照組、Micro RNA-126抑制物陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑組和正常對(duì)照組。用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將人工合成核苷酸序列(Micro RNA-126類似物、Micro RNA-126抑制物、Micro RNA-126類似物陰性對(duì)照物、Micro RNA-126抑制物陰性對(duì)照物)分別轉(zhuǎn)染至相應(yīng)組細(xì)胞中,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中Micro RNA-126的相對(duì)表達(dá)量。4.運(yùn)用Western blot法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)胰島素受體底物-1(IRS-1)、磷脂酰肌醇激酶p85β(PIK3R2)、蛋白激酶B-2(Akt-2)、磷酸化Akt-2(p-Akt-2)的蛋白表達(dá)水平。5.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析由SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行,數(shù)據(jù)結(jié)果由均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),并用單因素方差分析(one-way ANOVA)及t檢驗(yàn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,當(dāng)P0.05時(shí)表示數(shù)據(jù)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),FAM-NC及inhibitor FAM-NC可以有效的轉(zhuǎn)染張氏肝細(xì)胞,并且呈現(xiàn)濃度依賴性,80 nmol/L為最佳轉(zhuǎn)染濃度。2.在Micro RNA-126類似物組中,細(xì)胞內(nèi)Micro RNA-126的相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著增加(P0.05);其他組細(xì)胞中Micro RNA-126的相對(duì)表達(dá)量與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.在Micro RNA-126類似物組細(xì)胞中IRS-1、PIK3R2的相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯減少,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05),其余各組細(xì)胞中IRS-1、PIK3R2的相對(duì)表達(dá)量間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Micro RNA-126類似物組細(xì)胞Akt-2的磷酸化水平(p-Akt-2/Akt-2)較正常對(duì)照組明顯降低(P0.05),其余各組中p-Akt-2/Akt-2較正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)結(jié)論Micro RNA-126通過(guò)作用于IRS-1/PIK3R2/Akt-2胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路影響肝細(xì)胞的糖代謝功能。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.1
【目錄】：

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本文編號(hào)：164200