本文選題：微小核糖核酸-21　切入點(diǎn)：核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN　出處：《貴州醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)發(fā)生發(fā)展過程中,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)可通過激活Smads信號(hào)通路誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的發(fā)生及腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)的過度沉積,進(jìn)而造成腎組織廣泛的纖維化[1]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)[2-3],隨DN病程的進(jìn)展,可導(dǎo)致TGF-β1/Smads信號(hào)通路持續(xù)激活和微小核糖核酸-21(mi R-21)表達(dá)逐漸增加,兩者均參與了EMT的發(fā)生以及ECM的沉積,從而促進(jìn)纖維化的發(fā)生發(fā)展。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN(Ski-related novel protein N)作為TGF-β1/Smads信號(hào)通路的重要負(fù)調(diào)控因子,在DN發(fā)生發(fā)展過程中其蛋白水平的減少,可導(dǎo)致TGF-β1的致纖維化效應(yīng)增強(qiáng)[4]。而Ski與SnoN為同一家族的成員,其啟動(dòng)子的3’UTR存在mi R-21的靶位點(diǎn),mi R-21可通過結(jié)合到SKI基因3’UTR抑制該基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。但在DN發(fā)病機(jī)制中mi R-21的效應(yīng)是否與SnoN有關(guān),兩者有何關(guān)聯(lián),目前未見報(bào)道。因此,本研究擬觀察糖尿病(DM)大鼠腎組織及高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中mi R-21和SnoN蛋白及m RNA水平的表達(dá)變化及相互影響,探討在DN發(fā)病過程中mi R-21的作用,以及與SnoN之間的關(guān)系和可能機(jī)制,從而進(jìn)一步闡明DN腎纖維化的發(fā)病機(jī)制。目的:觀察糖尿病(DM)大鼠腎組織及高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中mi R-21和SnoN蛋白及m RNA的表達(dá)變化及相互影響,探討mi R-21在DN發(fā)病過程中作用,以及與SnoN之間的關(guān)系和可能機(jī)制。方法:1.清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)復(fù)制DM大鼠模型,并設(shè)正常對(duì)照組(NC),每組n=10,于8周(w)、16w和24w分別處死各組大鼠。生化方法檢測(cè)血糖和24小時(shí)(h)尿蛋白;HE染色(hematoxylin-eosin staining)及Masson染色觀察腎組織形態(tài)變化及病理變化;免疫組織化學(xué)染色和Western blot法檢測(cè)各組大鼠腎組織SnoN、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、Smad3、p-Smad3(Ser423/425)、E鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(FN)和膠原蛋白Ⅲ(CollagenⅢ,ColⅢ)的表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time fluorescent quantitative-PCR,q RT-PCR)檢測(cè)mi R-21和SnoN m RNA的表達(dá)。2.NRK-52E細(xì)胞株(大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞),采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白α-SMA在NRK-52E中的表達(dá)和分布,觀察細(xì)胞形態(tài)以及生長(zhǎng)狀態(tài);分為以下兩個(gè)組:予正常糖[DMEM(含糖5.5 mmol/L)+2%FBS]和高糖[19.5mmol/L D-glucose+DMEM+2%FBS]環(huán)境分別培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞,每組細(xì)胞分別培養(yǎng)2 h、12h、24h和48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn);Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中SnoN、TGF-β1、Smad3、p-Smad3(Ser423/425)、E-cadherin、α-SMA的表達(dá)情況;q RT-PCR技術(shù)檢測(cè)mi R-21及SnoN m RNA的表達(dá)情況。3.采用免疫熒光染色或免疫熒光雙染檢測(cè)E-cadherin、α-SMA在不同糖環(huán)境NRK-52E細(xì)胞的表達(dá)和分布;通過對(duì)NRK-52E細(xì)胞進(jìn)行不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,分別過表達(dá)mi R-21或抑制mi R-21作用后予正常糖或高糖培養(yǎng)48h;Western blot方法檢測(cè)高糖環(huán)境下,增加mi R-21表達(dá)或抑制mi R-21作用后對(duì)NRK-52E細(xì)胞SnoN、E-cadherin和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)的影響;q RT-PCR技術(shù)檢測(cè)SnoN m RNA和Smad7 m RNA的表達(dá)。4.通過轉(zhuǎn)染敲低NRK-52E細(xì)胞SnoN表達(dá)后予正常糖或高糖培養(yǎng)48h,Western blot和q RT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;予人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bone morphogenetic protein 7,BMP-7)200ng/ml加入高糖同時(shí)培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞48h;Western blot方法檢測(cè)SnoN、E-cadherin、Col-Ⅲ蛋白的表達(dá);q RT-PCR技術(shù)檢測(cè)mi R-21的表達(dá)。結(jié)果:1.生化指標(biāo)及腎組織形態(tài)學(xué)變化顯示DM大鼠模型復(fù)制成功且并發(fā)DN;與NC組相比,DM組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad3(Ser423/425)、α-SMA蛋白表達(dá)增加而E-cadherin蛋白表達(dá)減少(p0.05),mi R-21和SnoNm RNA表達(dá)隨疾病進(jìn)程呈時(shí)間依賴性增加,但SnoN蛋白表達(dá)隨疾病進(jìn)展呈時(shí)間依賴性減少(p0.05),相關(guān)性分析結(jié)果提示大鼠腎組織中mi R-21和SnoN蛋白的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.797,p0.01);2.與NG組相比,HG組腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、p-Smad3(Ser423/425)、α-SMA蛋白表達(dá)增加而E-cadherin蛋白表達(dá)的減少(p0.05),mi R-21表達(dá)和SnoN m RNA隨高糖刺激時(shí)間延長(zhǎng)呈時(shí)間依賴性增加,而SnoN蛋白表達(dá)則呈時(shí)間依賴性減少(p0.05),相關(guān)性分析結(jié)果提示NRK-52E細(xì)胞中mi R-21和SnoN蛋白的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.899,p0.01);3.NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染p HAGE-mi R-21(過表達(dá)mi R-21)后高糖培養(yǎng),高糖進(jìn)一步減少E-cadherin的表達(dá)而增加CollagenⅢ的表達(dá)(p0.05),且NRK-52E細(xì)胞過表達(dá)mi R-21后高糖培養(yǎng),可顯著減少SnoN、Smad7 m RNA及蛋白的表達(dá)(p0.05);相反,NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-21-sponge(抑制mi R-21作用)后高糖培養(yǎng),可見E-cadherin的表達(dá)增加而CollagenⅢ的表達(dá)減少(p0.05);4.NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染SnoN sh RNA后高糖培養(yǎng),進(jìn)一步減少了E-cadherin表達(dá)而增加了CollagenⅢ的表達(dá)(p0.05),并且mi R-21的表達(dá)上調(diào);相反,若高糖培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞的同時(shí)加入外源性細(xì)胞因子BMP-7,BMP-7可上調(diào)SnoN的表達(dá),從而恢復(fù)E-cadherin的表達(dá)并下調(diào)CollagenⅢ的表達(dá),同時(shí)可減少mi R-21的表達(dá);但NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染SnoN sh RNA后予高糖和BMP-7同時(shí)培養(yǎng),可見BMP-7上調(diào)SnoN表達(dá)、抗纖維化和抑制mi R-21的效應(yīng)均被削弱。結(jié)論:1.DM及高糖環(huán)境下,TGF-β1通過激活腎小管上皮細(xì)胞下游的Smad3信號(hào)通路,上調(diào)mi R-21的表達(dá);增多的mi R-21可能通過抑制SnoN m RNA的翻譯,導(dǎo)致SnoN蛋白水平降低,使得TGF-β1/Smad3信號(hào)通路失去控制而過度活化,促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展。2.高糖環(huán)境下,腎小管上皮細(xì)胞過表達(dá)mi R-21可促進(jìn)EMT的發(fā)生和ECM的沉積,而抑制mi R-21作用可減輕EMT的發(fā)生和ECM的沉積,mi R-21可能通過調(diào)控SnoN、Smad7的表達(dá),發(fā)揮致纖維化效應(yīng)。3.高糖環(huán)境下,增加腎小管上皮細(xì)胞SnoN的表達(dá)可抑制mi R-21的表達(dá)和纖維化病變;相反,敲低SnoN可以促進(jìn)mi R-21的表達(dá)和纖維化病變。
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【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1641881