本文選題：糖尿病性心肌病　切入點：溴區(qū)包含蛋白7　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景糖尿病性心肌病(DCM)是一種糖尿病引起的,與冠狀動脈疾病、心臟瓣膜病和高血壓無關(guān)的心臟疾病。DCM是導(dǎo)致糖尿病相關(guān)發(fā)病率和死亡率的主要原因。過去十年中對DCM的發(fā)病機(jī)制研究較多,主要包括受損的鈣穩(wěn)態(tài)、胰島素抵抗、脂質(zhì)攝取的增加、葡萄糖毒性、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS系統(tǒng))激活和氧化應(yīng)激。上述機(jī)制均可引起糖尿病患者廣泛的心肌結(jié)構(gòu)異常,如心肌間質(zhì)纖維化、心肌細(xì)胞肥大和凋亡,并且最終導(dǎo)致左心室肥大和舒張和/或收縮功能障礙。其中,心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病性心肌病發(fā)展過程中的主要事件。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中,早期即可觀察到心肌細(xì)胞凋亡的顯著增加。由于成人心肌細(xì)胞很少增殖,因此心肌細(xì)胞的丟失最終將導(dǎo)致心功能受損。因此,抑制心肌凋亡是預(yù)防DCM的重要策略。有研究報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變非常敏感,在DCM的發(fā)生發(fā)展過程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要的作用。然而,糖尿病誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制仍不明確。溴區(qū)包含蛋白7(BRD7)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的蛋白。在人體組織中普遍表達(dá),包括腦、心臟、肺、結(jié)腸和乳腺。它是溴區(qū)包含蛋白家族成員之一,并且作為重要的腫瘤抑制因子廣泛參與細(xì)胞的各種生物學(xué)活動,如細(xì)胞生長與分化、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。近年來越來越多的研究報道BRD7在細(xì)胞凋亡始動環(huán)節(jié)的作用。最近一項研究表明,在肥胖小鼠的肝臟中BRD7通過調(diào)節(jié)XBP-1s核轉(zhuǎn)位調(diào)控ERS信號通路。目前BRD7的研究多集中在腫瘤疾病中,對于DCM心肌組織中BRD7的表達(dá)及作用尚未見報道。本研究采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠模型為研究對象,探討B(tài)RD7在DCM心肌組織中的表達(dá)及其對DCM的作用。研究目的1.研究BRD7在DCM心肌細(xì)胞中的表達(dá)情況;2.研究BRD7對DCM大鼠心室重構(gòu)及心功能異常的影響;3.研究BRD7對糖尿病誘導(dǎo)的心肌間質(zhì)纖維化及心肌細(xì)胞凋亡的影響。研究方法1.慢病毒shRNA-BRD7載體的構(gòu)建設(shè)計3對針對大鼠BRD7基因的shRNA質(zhì)粒,應(yīng)用蛋白免疫印跡法分析每個質(zhì)粒的干擾效率,選擇其中效率最高的質(zhì)粒,構(gòu)建成含有綠色熒光蛋白(GFP)報告基因的慢病毒載體。針對BRD7的干擾序列為5'-GGACTCTGGAGATGC-TGAA-3',空載體序列為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。2.1型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建及shRNA-BRD7慢病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染將60只健康雄性Wistar大鼠(平均體重200±20g)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為四組(每組15只):正常對照組(NC組)、糖尿病組(DM組)、糖尿病+慢病毒空載體組(DM+shRNA-N.C組)及糖尿病+BRD7基因沉默組(DM+shRNA-BRD7組)。三組糖尿病大鼠分別給與一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),劑量為60mg/kg。正常對照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸鹽緩沖液(PH4.5)。STZ注射后1周,取大鼠尾靜脈血測量空腹血糖,連續(xù)2次空腹血糖≥ 16.7 mmol/L認(rèn)為1型糖尿病造模成功。STZ注射后12周,DM+shRNA-BRD7組大鼠頸靜脈注射1× 108 UT/50μl的shRNA-BRD7慢病毒載體,DM+shRNA-N.C組大鼠頸靜脈注射同等劑量的慢病毒空載體。病毒轉(zhuǎn)染4周后,對所有大鼠實施安樂死,留取血液及左室組織用于組織學(xué)及分子生物學(xué)檢測。3.各組實驗大鼠基本指標(biāo)的測量血糖的檢測:實驗過程中,四組大鼠分別于STZ注射前(0周)、STZ注射后1周、12周、16周取尾靜脈血檢測空腹血糖水平。血壓和心率的檢測:于實驗?zāi)┢?檢測各組大鼠的心率(HR)、尾動脈收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)和平均動脈壓(MBP)。每只動物測量3次后取平均值。4.超聲心動圖檢測實驗過程中,分別于STZ注射后12周、16周,采用M超及脈沖多普勒超聲成像技術(shù)獲取各組大鼠心功能參數(shù),評價心功能。5.組織形態(tài)學(xué)檢測各組大鼠心臟取材后,制備石蠟切片,進(jìn)行常規(guī)HE染色以觀察心臟組織形態(tài)及心肌細(xì)胞形態(tài)情況,Masson染色及天狼星紅染色用以檢測心肌膠原含量。采用免疫組織化學(xué)染色法,檢測心肌組織內(nèi)BRD7的表達(dá)及分布情況。6.TUNEL 染色采用TUNEL染色法檢測各組動物左室心肌組織中心肌細(xì)胞的凋亡水平。7.Western blot 檢測提取各組大鼠左室心肌組織蛋白,分別檢測心肌組織內(nèi)BRD7、CHOP、cleaved caspase-3、full length caspase-3、p-AKT(Ser473)、p-AKT(Thr308)、t-AKT、Bax、Bcl-2和β-actin的蛋白表達(dá)水平。8.統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,p0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果1.實驗動物的基本情況與正常大鼠相比,糖尿病組大鼠呈現(xiàn)多飲、多食、多尿及體態(tài)消瘦等癥狀。給予BRD7基因沉默治療后,DM+shRNA-BRD7組大鼠一般狀態(tài)較慢病毒空載體組稍微改善。2.各組實驗動物的基本指標(biāo)實驗初期,各組大鼠血糖無明顯差異,STZ注射后一周,三組糖尿病大鼠血糖水平明顯高于正常對照組并維持到實驗?zāi)┢?抑制BRD7血糖水平較糖尿病組大鼠無明顯改善。實驗?zāi)┢?各組大鼠血壓無明顯差異。DM組與正常對照組比較,體重(BW)明顯降低,心率(HR)、心臟重量(HW)及心身比(HW/BW)升高;與糖尿病空載體對照組大鼠相比,抑制BRD7可降低HW和HW/BW,對體重及心率無明顯影響。3.BRD7在DCM大鼠左室心肌組織中表達(dá)升高與正常對照組比較,糖尿病組大鼠心肌組織中的BRD7蛋白水平表達(dá)明顯升高。ShRNA-BRD7慢病毒轉(zhuǎn)染DM+shRNA-BRD7組大鼠心肌組織4周后,BRD7的蛋白表達(dá)較空載體對照組顯著降低。4.抑制BRD7改善DCM大鼠的心功能異常糖尿病成模后12周,與正常對照組比較,三組糖尿病大鼠均呈現(xiàn)出左室舒張功能受損,主要表現(xiàn)為E/A降低;并伴有左室收縮功能障礙,表現(xiàn)為左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)及左室短軸縮短率(FS)降低;同時左室舒張末內(nèi)徑(LVEDd)、左室質(zhì)量(LVmass)及左室后壁厚度(LVPWd)均增加。實驗?zāi)┢谂c正常對照組大鼠相比,糖尿病組大鼠E/A、LVEF、FS明顯降低,LVEDd、LVPWd、LVmass顯著增加。抑制BRD7可明顯改善糖尿病引起的心功能障礙。5.抑制BRD7明顯改善糖尿病誘導(dǎo)的心室重構(gòu)和纖維化程度與正常大鼠相比,糖尿病大鼠心臟形態(tài)明顯增大,心尖部變圓潤,心腔擴(kuò)大。鏡下觀察及分析,心肌細(xì)胞直徑明顯增寬,形態(tài)不規(guī)則,排列紊亂。抑制BRD7可顯著改善心臟形態(tài)及結(jié)構(gòu)的變化。Masson染色及天狼星紅染色顯示糖尿病組大鼠心肌間質(zhì)纖維化程度明顯高于正常組大鼠。與糖尿病及慢病毒空載體組相比,抑制BRD7可明顯緩解心肌間質(zhì)膠原沉積。6.抑制BRD7減少DCM大鼠的心肌細(xì)胞凋亡Western blot和TUNEL染色結(jié)果顯示糖尿病大鼠心肌組織中cleaved caspase-3蛋白表達(dá)、Bax/Bcl-2的比值和心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加;然而,與慢病毒空載體組相比,抑制BRD7明顯降低糖尿病誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。CHOP是ERS通路的特異性凋亡因子。與正常大鼠比較,糖尿病大鼠心肌組織CHOP的蛋白表達(dá)明顯升高,抑制BRD7可有效降低CHOP的表達(dá)。提示BRD7介導(dǎo)DCM心肌細(xì)胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路有關(guān)。7.BRD7負(fù)向調(diào)控糖尿病大鼠心肌組織中AKT的活性Western blot檢測結(jié)果顯示,糖尿病組大鼠心肌組織中p-AKT(Ser473)和p-AKT(Thr308)的表達(dá)明顯低于正常對照組,抑制BRD7后能夠明顯升高糖尿病大鼠心肌組織中AKT(Ser473)和AKT(Thr308)磷酸化水平。研究結(jié)論1.1型DCM大鼠心肌組織中BRD7蛋白水平表達(dá)明顯升高;2.BRD7基因沉默明顯改善糖尿病引起的心功能障礙、心室重構(gòu)及心肌間質(zhì)纖維化;3.BRD7基因沉默通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路減少糖尿病誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。研究背景糖尿病(DM)是一種嚴(yán)重的、復(fù)雜的代謝性疾病,影響著全世界約4%的人口。糖尿病性心肌病(DCM)是在沒有其他血管病理的情況下糖尿病引起的心肌特異性疾病。DCM的發(fā)病機(jī)制是一個緩慢且復(fù)雜的過程,其主要歸因于自主神經(jīng)異常、代謝紊亂、酶功能異常和間質(zhì)性纖維化。此外,心肌細(xì)胞凋亡在糖尿病性心肌病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。溴區(qū)包含蛋白7(BRD7)是溴區(qū)包含蛋白家族的成員之一。BRD7作為腫瘤抑制因子,在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮不可忽視的作用。有研究表明在肝癌細(xì)胞中,ERK信號通路的激活可誘導(dǎo)BRD7的蛋白表達(dá)。高糖刺激所介導(dǎo)的氧化應(yīng)激及細(xì)胞因子均可激活ERK通路,使下游因子活性增強(qiáng),參與DCM的發(fā)生發(fā)展過程。然而,在高糖條件下,ERK通路是否介導(dǎo)BRD7的表達(dá)尚未見相關(guān)報道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)BRD7介導(dǎo)DCM的心肌細(xì)胞凋亡,其具體機(jī)制尚不明確。近期一項研究表明,在肥胖小鼠的肝細(xì)胞中,BRD7通過結(jié)合P85α促進(jìn)XBP1核轉(zhuǎn)位并增強(qiáng)XBP1的轉(zhuǎn)錄活性從而調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)信號通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器,負(fù)責(zé)脂質(zhì)合成、鈣穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)折疊和成熟。多種因素可以使ER功能紊亂從而導(dǎo)致未折疊/錯誤折疊蛋白的積累,如氧化應(yīng)激、缺血和鈣穩(wěn)態(tài)異常,這個過程稱為ERS。ERS早期作用為抑制蛋白質(zhì)翻譯和轉(zhuǎn)運,促進(jìn)分子伴侶表達(dá),使ER功能恢復(fù)正常;然而,當(dāng)刺激持續(xù)存在或過強(qiáng)時,ERS便啟動細(xì)胞凋亡通路,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。慢性高血糖刺激誘導(dǎo)ERS信號通路的激活,包括糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、X盒結(jié)合蛋白1(XBP-1)和C/EBP同源蛋白(CHOP)。我們通過STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠模型證實ERS介導(dǎo)糖尿病引起的心肌細(xì)胞凋亡。在DCM病程中,XBP1誘導(dǎo)ERS特異性凋亡因子CHOP的表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。盡管ERS被證實參與DCM中心肌細(xì)胞凋亡過程,但其具體機(jī)制尚不明確。在DCM中,BRD7的促調(diào)亡作用是否與ERS信號通路相關(guān)仍有待研究。綜上所述,本實驗采用H9c2心肌細(xì)胞系為研究對象,高糖刺激H9c2心肌細(xì)胞系模擬糖尿病狀態(tài)下高糖血癥內(nèi)環(huán)境,探討高糖刺激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞BRD7表達(dá)上調(diào)的機(jī)制及BRD7介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。研究目的1.探討B(tài)RD7對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響;2.探討高糖刺激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞BRD7表達(dá)升高的機(jī)制;3.探討高糖刺激下BRD7介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。研究方法1.細(xì)胞培養(yǎng)本實驗以H9c2心肌細(xì)胞系為實驗對象,采用5.5mmol/L的正常糖濃度培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞作為正常對照組(NG)。以33.3mmol/L的葡萄糖作為高糖(HG)刺激,分別以HG刺激心肌細(xì)胞6h,12h,24h,48h。5.5mmol/L葡萄糖+27.5mmol/L甘露醇作為高滲對照組(OC),分別刺激心肌細(xì)胞6h,12h,24h,48h。2.細(xì)胞干預(yù)采用慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA-BRD7的技術(shù)抑制心肌細(xì)胞BRD7的基因表達(dá),慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA-N.C作為陰性對照組;采用特異性抑制劑U0126抑制ERK通路的活性,DMSO作為陰性對照組。3.TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡采用TUNEL染色法檢測不同條件下心肌細(xì)胞的凋亡水平。4.Western blot 檢測收集各組細(xì)胞,提取總蛋白及核蛋白,分別檢測BRD7、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、full length caspase-3、CHOP、XBP-1s、p-ERK、t-ERK、p-AKT和t-AKT的蛋白表達(dá)水平。5.激光共聚焦顯微鏡采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測心肌細(xì)胞中BRD7的分布情況,同時檢測不同刺激下心肌細(xì)胞中XBP-1s的核轉(zhuǎn)位情況。5.統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,p0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果1.高糖刺激時間依賴性誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞系的凋亡及BRD7的表達(dá)采用高糖分別刺激H9c2心肌細(xì)胞6h,12h,24h,48h。Western blot結(jié)果顯示,與NG組相比,高糖刺激24h和48h后Bax/Bcl-2的比值及cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平顯著升高。OC組心肌細(xì)胞凋亡水平與NG組無顯著差異。與對照組比較,高糖刺激心肌細(xì)胞24h后BRD7蛋白表達(dá)開始升高,并且于48h達(dá)到頂峰。高滲刺激對BRD7的表達(dá)沒有明顯影響。2.抑制BRD7可顯著減少高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA-BRD7技術(shù)可明顯抑制心肌細(xì)胞BRD7的蛋白表達(dá)。Western blot及TUNEL染色結(jié)果顯示,與慢病毒空載體組相比,抑制BRD7顯著降低Bax/Bcl-2的比值、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡率。3.高糖刺激通過激活ERK通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞BRD7的表達(dá)及細(xì)胞凋亡與NG組相比,高糖刺激誘導(dǎo)ERK1/2的磷酸化;與高糖陰性對照組相比,特異性抑制劑U0126顯著降低ERK1/2的活性,同時BRD7蛋白表達(dá)明顯減少。細(xì)胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),高糖刺激能夠升高細(xì)胞核中BRD7的表達(dá),抑制ERK通路后,細(xì)胞核中BRD7的表達(dá)明顯減少。我們進(jìn)一步研究了 ERK通路對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響。與正常組相比,高糖刺激降低生存信號AKT的磷酸化,抑制ERK1/2的活性明顯升高p-AKT的表達(dá);同時,與對照組相比,抑制ERK1/2磷酸化顯著降低Bax/Bcl-2比值及cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)。4.BRD7通過調(diào)控ERS通路介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡4.1.高糖刺激下BRD7調(diào)控XBP-1s的核轉(zhuǎn)位Western blot結(jié)果顯示,與對照組比較,高糖刺激誘導(dǎo)XBP-1s核轉(zhuǎn)位及總蛋白的表達(dá);與慢病毒空載體組相比,BRD7基因沉默明顯抑制XBP-1s核轉(zhuǎn)位,但對其總蛋白表達(dá)無顯著影響。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)驗證不同條件下心肌細(xì)胞中BRD7和XBP-1s的定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常條件下,BRD7位于細(xì)胞核中,XBP1主要位于胞質(zhì)內(nèi);高糖刺激誘導(dǎo)XBP-1s向核內(nèi)轉(zhuǎn)移并與BRD7共表達(dá);BRD7基因沉默后明顯抑制XBP-1s的核轉(zhuǎn)位。4.2.抑制BRD7明顯減少高糖誘導(dǎo)的CHOP蛋白表達(dá)采用western blot檢測BRD7對XBP-1s下游凋亡因子CHOP表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,與正常組相比,高糖刺激心肌細(xì)胞24h和48h后CHOP蛋白表達(dá)顯著升高,高滲刺激對CHOP表達(dá)無顯著影響。同時,與空載體組相比,抑制BRD7可明顯降低高糖誘導(dǎo)的CHOP表達(dá)。研究結(jié)論1.高糖刺激通過激活ERK通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞BRD7的表達(dá);2.抑制BRD7明顯減少高糖介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡;3.BRD7基因沉默通過抑制XBP-1s/CHOP信號通路降低高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R542.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1640234